人源化肝臟嵌合體小鼠模型的建立及MSC介導(dǎo)的免疫抑制作用在肝細胞移植中的應(yīng)用.pdf

1、應(yīng)用人肝細胞異種移植到受體小鼠肝內(nèi)建立人源化肝臟的嵌合體小鼠（人鼠嵌合肝），對藥物代謝、乙型肝炎病毒等嗜肝性病毒及其疫苗的研究具有重要意義。延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因剔除小鼠（Fah-/-小鼠），是模擬遺傳型酪氨酸血癥Ⅰ型疾病建立的小鼠模型。作為國際上公認(rèn)度很高的肝損傷模型之一，F(xiàn)ah-/-小鼠已被廣泛應(yīng)用于肝臟再殖的研究。Fah-/-小鼠是開展肝細胞移植的理想模型，100個移植的肝細胞就能重建Fa-/-小鼠肝臟5％的細胞（約2×105

2、個細胞），并可重建肝小葉的結(jié)構(gòu)與功能。非肥胖糖尿病/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠具有T、B淋巴細胞聯(lián)合免疫缺陷、NK細胞活性低下、無循環(huán)補體、無巨噬細胞和抗原提呈細胞功能損害等多種先天和獲得性免疫缺陷，不易發(fā)生免疫逃逸，是理想的異種移植模型。本研究結(jié)合Fah-/-小鼠的肝臟再殖優(yōu)勢和Nod/Scid小鼠可以異種移植的特點，將兩個小鼠品系進行雜交繁育建立Fah-/-Nod/Scid小鼠品系，開展人肝細胞移植Fah-/-Nod/

3、Scid小鼠建立人源化肝臟嵌合體小鼠模型的研究。通過觀察人肝細胞在Fah-/-Nod/Scid小鼠肝臟中的再殖及其程度，評價再殖的人肝細胞是否具有正常的肝細胞功能，評價利用人肝細胞移植Fah-/-Nod/Scid小鼠建立人鼠嵌合肝模型的可行性。
　　 同時，在臨床上開展肝細胞移植治療肝臟疾病的實踐中，應(yīng)用同種異基因人肝細胞移植時可能導(dǎo)致的免疫反應(yīng)是不得不考慮的問題。間充質(zhì)干細胞(MSCs)能與先天或獲得性免疫系統(tǒng)的細胞相互作用，

4、通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的效應(yīng)分子發(fā)揮免疫抑制和組織修復(fù)的作用，為其在臨床上應(yīng)用以調(diào)節(jié)肝細胞移植時的免疫反應(yīng)提供了可能的選擇方案。因此，在第二部分研究中，我們以同種異基因小鼠肝細胞與MSCs混合移植Fah-/-小鼠模型，以移植細胞是否再殖受體小鼠肝臟作為評價指標(biāo)，觀察間充質(zhì)干細胞在肝細胞移植中是否發(fā)揮免疫抑制作用，以及這種作用是否能促進同種異基因小鼠肝細胞在受體肝臟中的再殖。
　　 在第一部分研究中，首先，通過雜交、基因型鑒定及保種繁育

5、，我們建立了Fah-/-Nod/Scid小鼠品系，該品系可以純合保種并能正常繁殖;其次，我們開展了同種異基因小鼠肝細胞移植Fah-/-Nod/Scid小鼠的工作。通過觀察小鼠肝細胞在Fah-/-Nod/Scid小鼠肝臟中的再殖及其程度，評價建立的Fah-/-Nod/Scid小鼠是否具備免疫缺陷Fah-/-小鼠的基本生物學(xué)特性，為下一步進行人肝細胞移植建立人鼠嵌合肝模型奠定基礎(chǔ);第三，分離原代人肝細胞并移植Fah-/-Nod/Scid小鼠

6、。在人肝細胞移植前后，我們針對受體小鼠采取了一系列預(yù)處理措施，包括:人肝細胞移植前一周逐步撤除Fah-/-小鼠抑制藥物NTBC，提前誘導(dǎo)受體小鼠肝臟的損傷以形成外源細胞植入的微環(huán)境;細胞移植后以臨床上常用的免疫抑制劑——FK506抑制異種細胞移植后的免疫排斥反應(yīng)，同時促進植入人肝細胞的增殖。通過以上處理措施，觀察人肝細胞在Fah-/-Nod/Scid小鼠肝臟中的再殖及再殖的肝細胞是否具有正常的肝細胞功能。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，移植的

7、人肝細胞能夠?qū)崿F(xiàn)在Fah-/-Nod/Scid小鼠肝臟中的顯著增殖，肝臟再殖程度達到30％以上。采用體重曲線、肝功能和人肝細胞功能蛋白表達等三方面指標(biāo)評價嵌合肝臟中人肝細胞的功能，結(jié)果表明再殖的肝細胞具有正常的人肝細胞功能。以上結(jié)果表明，F(xiàn)ah-/-Nod/Scid小鼠可以作為理想的可規(guī)模應(yīng)用的人鼠嵌合肝模型，該技術(shù)體系的改進簡化了Fah-/-小鼠作為人源化肝臟小鼠模型的實用性問題。
　　 在第二部分研究中，應(yīng)用提前撤除受體小鼠

8、抑制藥物NTBC的預(yù)處理方案，我們分別將未處理及以細胞因子IFN-γ和TNF-α活化處理的MSCs混合C57BL/6J品系小鼠肝細胞移植129S4品系的Fah-/-小鼠，同時選擇在混合移植前1天及移植后1、3、5、7天分別對受體尾靜脈注射MSCs以增強其免疫抑制作用。采用免疫組織化學(xué)、體重曲線以及肝臟生化指標(biāo)，觀察不同處理的MSCs在同種異基因小鼠肝細胞移植中的免疫抑制作用。結(jié)果表明，C57BL/6J肝細胞單獨移植129S4 Fah-/

9、-小鼠時，未見任何移植細胞的植入和增殖;C57BL/6J肝細胞混合未經(jīng)細胞因子誘導(dǎo)處理MSCs移植時，129S4 Fah-/-小鼠肝臟中出現(xiàn)單個散在的移植細胞植入;C57BL/6J肝細胞混合經(jīng)細胞因子IFN-γ和TNF-α活化處理MSCs移植時，移植細胞在受體肝臟中的再殖程度提高，損傷的肝臟功能明顯改善。這些結(jié)果初步表明MSCs在同種異基因小鼠肝細胞移植中發(fā)揮了一定的免疫抑制作用，并改善了受體小鼠的肝臟功能，為進一步開展應(yīng)用MSCs調(diào)節(jié)