自然殺傷細(xì)胞對(duì)小鼠Heps肝癌移植瘤的抑制作用及機(jī)理探討.pdf

1、目的：研究自然殺傷細(xì)胞(NK)對(duì)原發(fā)性肝癌Heps移植瘤小鼠的增殖抑制作用和機(jī)理探討。
　　 方法：誘導(dǎo)擴(kuò)增昆明小鼠脾細(xì)胞來源的NK細(xì)胞，體外培養(yǎng)誘導(dǎo)NK細(xì)胞。隨機(jī)取60只8-12周齡雄性昆明小鼠，接種Heps肝癌細(xì)胞于其背側(cè)皮下，建立Heps肝癌移植瘤模型。將模型鼠隨機(jī)分為4組（每組15只）：①生理鹽水(NS)對(duì)照組，此組小鼠每只注射NS對(duì)照組0.1ml，隔日注射，共3次；②NK細(xì)胞治療組1,此組小鼠每只注射3×105/ml的

2、NK細(xì)胞0.1ml(即每只小鼠注射NK細(xì)胞3X104個(gè))，隔日注射，共3次；③NK細(xì)胞治療2，此組小鼠每只注射3×106/ml的NK細(xì)胞0.1ml(即每只小鼠注射NK細(xì)胞3×105個(gè))，隔日注射，共3次；④NK細(xì)胞治療組3，此組小鼠每只注射3×107/ml的NK細(xì)胞0.1ml(即每只小鼠注射NK細(xì)胞3×106個(gè))，隔日注射，共3次。其中，每組各有10只單獨(dú)用于觀察生存期。(1)自注射日起，隔日測量各組小鼠腫瘤長、短徑，計(jì)算注射后腫瘤體積

3、。(2)記錄注射當(dāng)天開始至小鼠死亡的時(shí)間，計(jì)算各組小鼠平均生存時(shí)間。(3)于注射后第15d,各組分別處死5只小鼠。取腫瘤組織，石蠟包埋并切片，蘇木素-伊紅(hematoxylin-esosin,HE)染色后光學(xué)顯微鏡觀察。(4)于第15d取小鼠脾臟制成脾細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞術(shù)(Flow CytoMeter,FCM)檢測NK細(xì)胞比例。(5)于第15d取小鼠脾臟制成脾細(xì)胞懸液，以小鼠Heps肝癌細(xì)胞為靶細(xì)胞，乳酸脫氫酶(lactatedeh

4、ydrogenase,LDH)釋放法檢測小鼠脾細(xì)胞細(xì)胞毒活性。(6)取各組小鼠腫瘤組織切片，分別應(yīng)用Bcl-2抗體、Bax抗體和血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)抗體，行免疫組織化學(xué)染色。計(jì)數(shù)局部腫瘤組織中Bcl-2陽性、Bax陽性細(xì)胞數(shù)量，并應(yīng)用圖像分析軟件對(duì)腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。
　　 結(jié)果：
　　 1．成功誘導(dǎo)擴(kuò)增小鼠脾細(xì)胞來源NK細(xì)

5、胞。
　　 2．小鼠Heps肝癌腹水瘤細(xì)胞成功制備小鼠Heps肝癌移植瘤模型，成瘤率100％。
　　 3．小鼠Heps肝癌腹水瘤細(xì)胞接種于到昆明小鼠背側(cè)皮下，并同時(shí)給各組小鼠回輸不同濃度的NK細(xì)胞以及生理鹽水，隔日測量各組小鼠腫瘤的的大小，第20d,治療1組小鼠腫瘤的體積(1757 mm3)較對(duì)照組(5012mm3)明顯減小(P＜0.01)。
　　 4．回輸后60d時(shí)，治療1組最后一只小鼠死亡，而其余各組小鼠均早

6、已死亡，治療1組小鼠的生存期（平均生存期41天）較對(duì)照組（平均生存期20d）、治療3組（平均生存期18d）顯著延長(P＜0.01），較治療2組（平均生存期21d）也明顯延長(P＜0.05）。
　　 5．各組小鼠腫瘤HE染色治療1組、2組、3組小鼠腫瘤細(xì)胞形態(tài)消失，壞死明顯，組織中炎性細(xì)胞浸潤明顯，血管較NS對(duì)照組少。
　　 6．各組小鼠脾細(xì)胞中NK細(xì)胞的含量第15d脾細(xì)胞懸液FACS檢測NK細(xì)胞比例，隨著注射NK細(xì)胞濃度

7、的升高，脾細(xì)胞中NK細(xì)胞的含量逐漸增高，各治療組與對(duì)照組均有顯著差別（P＜0.01），但是各治療組之間無明顯差別。
　　 7．各組小鼠脾細(xì)胞的細(xì)胞毒活性荷瘤小鼠脾中NK細(xì)胞殺傷活性隨濃度增高而增強(qiáng)。效靶比為10:1及20:1時(shí)，各治療組NK細(xì)胞殺傷活性明顯高于NS對(duì)照組(P＜0.01），而各治療組間沒有明顯差異。
　　 8．各組小鼠腫瘤Bcl-2-IHC染色：回輸后15d，治療1組、2組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組及

8、治療3組(P＜0.05）。
　　 9．各組小鼠腫瘤Bax-IHC染色：回輸后15d，治療1組Bax蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組及治療2組、3組(P＜0.05）。
　　 10．各組小鼠腫瘤VEGF-IHC染色：回輸后15d，治療1組VEGF表達(dá)明顯低于對(duì)照組及治療2組、3組(P＜0.05)。
　　 11．細(xì)胞免疫治療的副反應(yīng)回輸后11d，治療3組小鼠死亡3只，治療2組死亡2只，治療1組小鼠活動(dòng)良好，未見特殊不良反應(yīng)。