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文檔簡(jiǎn)介
1、本研究分為二部分:
第一部分:小鼠骨髓源性肥大細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
目的:利用小鼠骨髓干細(xì)胞體外誘導(dǎo)肥大細(xì)胞。
方法:從小鼠股骨獲得骨髓細(xì)胞,放入含10[%]胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基中,加入三種不同濃度的刺激因子,即IL-3和SCF均為10ng/ml,15ng/ml 或20ng/ml,放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4周,用免疫組化法觀察CD117的表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD117和FcεRIα雙陽(yáng)
2、性細(xì)胞的比例,甲苯胺藍(lán)染色法觀察細(xì)胞的成熟度,并與較常用的肥大細(xì)胞系P815做比較。
結(jié)果:小鼠股骨骨髓細(xì)胞經(jīng)三種濃度的刺激因子誘導(dǎo)4周后均可獲得肥大細(xì)胞,10ng/ml和15ng/ml的因子作用后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)所得細(xì)胞:CD117和FcεRIα雙陽(yáng)性的肥大細(xì)胞純度大于95[%],而20ng/ml時(shí)FcεRIα的表達(dá)卻有所降低,雙陽(yáng)性的細(xì)胞僅達(dá)90[%],而P815細(xì)胞系幾乎不表達(dá)FcεRIα。免疫組化檢測(cè)顯示:培養(yǎng)獲得
3、的細(xì)胞大部分均表達(dá)CD117。甲苯胺藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)獲得的肥大細(xì)胞核被染成深藍(lán)色,胞漿中布滿大量紫紅色的顆粒,呈現(xiàn)肥大細(xì)胞的典型特征;而P815卻少見(jiàn)典型的紫紅色異染顆粒。
結(jié)論:用IL-3和SCF各10ng/ml可在體外成功誘導(dǎo)高純度的小鼠骨髓源性肥大細(xì)胞,且其在表型和成熟度方面均優(yōu)于P815細(xì)胞系。
第二部分:小鼠骨髓源性肥大細(xì)胞體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生及機(jī)制探討
目的:探索小鼠骨髓源性肥大
4、細(xì)胞能否在體外誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,并分析其可能機(jī)制。
方法:從小鼠股骨獲取骨髓細(xì)胞,用IL-3和SCF各10ng/ml(完全RPMI 1640培養(yǎng)基)誘導(dǎo)四周。用甲苯胺藍(lán)染色法觀察肥大細(xì)胞異染顆粒;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD117和FcεRIα雙陽(yáng)性細(xì)胞比例。將肥大細(xì)胞與同基因來(lái)源的T細(xì)胞按不同比例(1:2,1:1,2:1)置于48孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),作為三個(gè)實(shí)驗(yàn)組;未加肥大細(xì)胞的單獨(dú)T細(xì)胞組作對(duì)照組。四個(gè)
5、組均加入CD3 抗體和CD28 抗體各2μg/ml,IL-2 1000U/ml,5天后流式檢測(cè)Foxp3的表達(dá)情況;RT-PCR,免疫組化法檢測(cè)肥大細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)。在上述混培體系中加入TGF-β1中和性抗體(1ug/ml),5天后流式檢測(cè)Foxp3的表達(dá)情況。
結(jié)果:與對(duì)照組相比,三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的Foxp3表達(dá)均升高(對(duì)照組:3.37%±0.40[%];
三個(gè)實(shí)驗(yàn)組依次為:8.23%±0.80[%],1
6、0.87%±1.25[%],13.63%±0.55[%])。且隨著肥大細(xì)胞比例的增加Foxp3+細(xì)胞的比例也增加。RT-PCR和免疫組化均觀察到TGF-β1的表達(dá)。而當(dāng)加入TGF-β1中和性抗體后,F(xiàn)oxp3+細(xì)胞的比例明顯下降(三個(gè)實(shí)驗(yàn)組依次為:4.47[%]±0.50[%],6.13[%]±0.35[%],6.40[%]±0.26[%])。
結(jié)論:肥大細(xì)胞能在體外誘導(dǎo)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)
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