小鼠肥大細(xì)胞體外誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3及其機制探討.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：小鼠骨髓源性肥大細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
　　 目的：利用小鼠骨髓干細(xì)胞體外誘導(dǎo)肥大細(xì)胞。
　　 方法:從小鼠股骨獲得骨髓細(xì)胞，放入含10[％]胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基中，加入三種不同濃度的刺激因子，即IL-3和SCF均為10ng/ml，15ng/ml 或20ng/ml，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4周，用免疫組化法觀察CD117的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD117和FcεRIα雙陽

2、性細(xì)胞的比例，甲苯胺藍(lán)染色法觀察細(xì)胞的成熟度，并與較常用的肥大細(xì)胞系P815做比較。
　　 結(jié)果:小鼠股骨骨髓細(xì)胞經(jīng)三種濃度的刺激因子誘導(dǎo)4周后均可獲得肥大細(xì)胞，10ng/ml和15ng/ml的因子作用后，流式細(xì)胞術(shù)檢測所得細(xì)胞：CD117和FcεRIα雙陽性的肥大細(xì)胞純度大于95[％]，而20ng/ml時FcεRIα的表達(dá)卻有所降低，雙陽性的細(xì)胞僅達(dá)90[％]，而P815細(xì)胞系幾乎不表達(dá)FcεRIα。免疫組化檢測顯示：培養(yǎng)獲得

3、的細(xì)胞大部分均表達(dá)CD117。甲苯胺藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)獲得的肥大細(xì)胞核被染成深藍(lán)色，胞漿中布滿大量紫紅色的顆粒，呈現(xiàn)肥大細(xì)胞的典型特征；而P815卻少見典型的紫紅色異染顆粒。
　　 結(jié)論:用IL-3和SCF各10ng/ml可在體外成功誘導(dǎo)高純度的小鼠骨髓源性肥大細(xì)胞，且其在表型和成熟度方面均優(yōu)于P815細(xì)胞系。
　　 第二部分：小鼠骨髓源性肥大細(xì)胞體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生及機制探討
　　 目的：探索小鼠骨髓源性肥大

4、細(xì)胞能否在體外誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，并分析其可能機制。
　　 方法：從小鼠股骨獲取骨髓細(xì)胞，用IL-3和SCF各10ng/ml(完全RPMI 1640培養(yǎng)基)誘導(dǎo)四周。用甲苯胺藍(lán)染色法觀察肥大細(xì)胞異染顆粒；流式細(xì)胞術(shù)檢測CD117和FcεRIα雙陽性細(xì)胞比例。將肥大細(xì)胞與同基因來源的T細(xì)胞按不同比例(1：2，1：1，2：1)置于48孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，作為三個實驗組；未加肥大細(xì)胞的單獨T細(xì)胞組作對照組。四個

5、組均加入CD3 抗體和CD28 抗體各2μg/ml，IL-2 1000U/ml，5天后流式檢測Foxp3的表達(dá)情況；RT-PCR，免疫組化法檢測肥大細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)。在上述混培體系中加入TGF-β1中和性抗體(1ug/ml)，5天后流式檢測Foxp3的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：與對照組相比，三個實驗組的Foxp3表達(dá)均升高(對照組：3.37％±0.40[％]；
　　 三個實驗組依次為：8.23％±0.80[％]，1

6、0.87％±1.25[％]，13.63％±0.55[％])。且隨著肥大細(xì)胞比例的增加Foxp3+細(xì)胞的比例也增加。RT-PCR和免疫組化均觀察到TGF-β1的表達(dá)。而當(dāng)加入TGF-β1中和性抗體后，F(xiàn)oxp3+細(xì)胞的比例明顯下降(三個實驗組依次為：4.47[％]±0.50[％]，6.13[％]±0.35[％]，6.40[％]±0.26[％])。
　　 結(jié)論：肥大細(xì)胞能在體外誘導(dǎo)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)