晚期糖基化終產(chǎn)物修飾的LDL激活肥大細胞脫顆粒的受體途徑的研究.pdf

1、研究背景:糖尿病的心血管并發(fā)癥已成為糖尿病患者致殘和致死的最主要原因。其中低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，LDL）經(jīng)晚期糖基化終產(chǎn)物(Advancedglycation end products，AGEs)修飾后形成的糖基化低密度脂蛋白（Advanced glycationend product modified low density lipoprotein，AGE-LDL）在體內(nèi)沉積后對促進動脈粥樣硬化

2、((Atherosclerosis，AS)的發(fā)生與發(fā)展起著尤其重要的作用。目前研究表明，肥大細胞(Mast cells，MCs)作為一重要細胞組成成分參與了AS的形成和免疫介導(dǎo)的斑塊失穩(wěn)定進程。然而，AGE-LDL對肥大細胞活性的影響及其相關(guān)機制尚未見報道。
　　 研究目的:研究AGE-LDL對小鼠骨髓來源肥大細胞(murine bone marrow derivedmast cells，mBMMCs)脫顆粒活性和toll樣受體

3、4（Toll-like receptor4，TLR4）的表達及其相關(guān)信號通路的影響，為糖尿病致AS和急性心血管事件提供新理論。
　　 研究方法:1.取行頸動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)患者的頸動脈斑塊，甲苯胺藍染色及激光掃描共聚焦顯微鏡（Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM）觀察斑塊內(nèi)MCs和AGEs的分布情況。2.獲取雄性、6-8周齡C57BL/6小鼠的骨髓細胞，經(jīng)含重組鼠白細胞介素-3（Recomb

4、inant murine Interleukin-3，rmIL-3）和重組鼠干細胞因子(Recombinant murine Stem cell factor，rmSCF)培養(yǎng)體系誘導(dǎo)骨髓細胞向肥大細胞分化，觀察細胞形態(tài)，4-6周后收集懸浮細胞，甲苯胺藍染色和流式細胞儀檢測鑒定MCs。3.給予不同濃度的AGE-LDL刺激分化成熟的MCs，分別檢測其釋放組胺及β-己糖胺酶水平，評價AGE-LDL刺激mBMMCs活化脫顆粒的能力。4.對可能

5、介導(dǎo)AGE-LDL激活肥大細胞的受體的研究:(1)實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-timequantitative polymerase chain reaction，Real-time PCR)、流式細胞儀和western-blot檢測mBMMCs表面TLR4的基因和蛋白表達。(2)檢測TLR4基因敲除(TLR4 knockout,TLR4 KO)的MCs經(jīng)AGE-LDL干預(yù)后的組胺及β-己糖胺酶釋放水平。5.研究AGE-LDL影響肥

6、大細胞活性可能的信號通路:(1)用AGE-LDL刺激肥大細胞，分別在不同時間點用Western-blot分析核因子κB(Nuclear-κB，NF-κB)、p38 MAPK、ERK1/2及JNK磷酸化情況。(2)分別用NF-κB、p38、ERK1/2抑制劑PDTC、SB203580、PD98059預(yù)孵肥大細胞后，再給予AGE-LDL刺激，觀察細胞釋放組胺和β-己糖胺酶的情況。
　　 研究結(jié)果:1.在人頸動脈斑塊標(biāo)本中觀測到肥大細

7、胞浸潤及AGEs的沉積。2.經(jīng)rmIL-3和rmSCF在體外誘導(dǎo)小鼠骨髓細胞4-6周后，甲苯胺藍染色顯示超過99％的細胞被染成藍紫色，流式細胞儀檢測細胞表面分子CD117和FcεRIa表達，雙陽性率超過95％，鑒定為成熟的肥大細胞。3.AGE-LDL呈濃度依賴性地激活肥大細胞釋放組胺和β-己糖胺酶，在30分鐘時達到峰值，與對照組和非糖化低密度脂蛋白(n-LDL)組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，在干預(yù)濃度為50ug/ml時作用最

8、強。4.AGE-LDL能夠通過上調(diào)mBMMCs表面TLR4的表達促進肥大細胞脫顆粒，TLR4敲除后AGE-LDL促肥大細胞脫顆粒的能力顯著下降。5.AGE-LDL刺激肥大細胞后能夠促進p38MAPK、ERK1/2和NF-κB磷酸化，對JNK磷酸化則無影響;AGE-LDL作用15分鐘時NF-κB和p38MAPK磷酸化表達己可升到最高，作用30分鐘時ERK1/2磷酸化表達最高。TLR4敲除的肥大細胞NF-κB、p38MAPK和ERK1/2磷

9、酸化水平不受AGE-LDL影響。p38MAPK、ERK1/2和NF-κB抑制劑SB203580、PD98059和PDTC均能拮抗AGE-LDL對肥大細胞釋放組胺和β-己糖胺酶的影響。
　　 研究結(jié)論:AGE-LDL能夠激活肥大細胞脫顆粒，促進其釋放組胺和β-己糖胺酶，該作用由TLR4介導(dǎo)，并與p38MAPK、ERK1/2和NF-κB信號通路的激活相關(guān)。AGE-LDL對肥大細胞脫顆?；钚缘挠绊懣赡苁菍?dǎo)致糖尿病患者易患AS和易發(fā)急性