基于SNP分型的熒光定量PCR檢測(cè)系列特異嵌合體方法的建立.pdf

1、[目的]建立一種用于移植后血細(xì)胞系列嵌合體定量分析的方法——基于SNP基因分型的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量技術(shù)，初步探討該技術(shù)在檢測(cè)移植后血細(xì)胞植入狀態(tài)中的應(yīng)用。 [方法]篩選了分別來自于5條不同染色體的7個(gè)特異性SNP位點(diǎn)，合成相應(yīng)的引物和探針；隨機(jī)抽取10例無關(guān)健康人模擬供受者，用免疫磁珠分選技術(shù)分離CD3+T淋巴細(xì)胞，利用Taqman探針建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，對(duì)模擬血細(xì)胞嵌合體進(jìn)行檢測(cè)，用以評(píng)價(jià)本方案的可行性和準(zhǔn)確性。最后

2、分別對(duì)3例異基因造血干細(xì)胞移植后病例的外周血樣進(jìn)行嵌合度分析。 [結(jié)果]1．免疫磁珠系統(tǒng)分選血細(xì)胞。 2．SNP位點(diǎn)選擇：從dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選了7個(gè)SNP位點(diǎn)，這7個(gè)SNP位點(diǎn)包括三種堿基替換類型，其中3個(gè)C/T，3個(gè)A/G，1個(gè)T/G。在中國(guó)人群中基因頻率介于0．3～0．8之間，且分布于不同染色體上。 3．基于SNP分型的定量方法的建立：使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣本DNA濃度。我們制作了rs4245位點(diǎn)C等位

3、基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，陰、陽(yáng)性模板經(jīng)實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增后，操作軟件輸出標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=-3.5976x+38.327，擴(kuò)增效率為0.897，R2=0.9969。說明：該標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系好，靈敏度不低于0.1％。 4．臨床標(biāo)本分析：用免疫磁珠分選CD3+T淋巴細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞純度達(dá)97％，擴(kuò)增該嵌合體樣本(供者基因型：TT，受體基因型：CC)，得到CT均值為21.23代入上述rs4245的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)輸出結(jié)果以及DNA總量計(jì)算得到