伯氏疏螺旋體分型多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用.pdf

1、萊姆病又稱萊姆包柔體病或萊姆疏螺旋體病，是因感染伯氏疏螺旋體引起的由蜱為媒介傳播的人畜共患傳染病。伯氏疏螺旋體是萊姆病的主要病原體，在分類學(xué)上屬于螺旋體目、螺旋體科中的包柔螺旋體屬，也稱疏螺旋體屬。萊姆病最初于1977年在美國康涅狄格州的萊姆鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)，因而得名。萊姆病臨床表現(xiàn)復(fù)雜，早期以慢性游走性紅斑為特征性表現(xiàn)，后可累及心臟、關(guān)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)，嚴(yán)重者可致死亡。萊姆病在世界上分布廣泛，遍布五大洲70多個(gè)國家，且發(fā)病人數(shù)在逐年增加，疫區(qū)不斷擴(kuò)

2、大，以美國發(fā)病率最高，我國也證實(shí)存在萊姆病的發(fā)病和流行，部分?。ㄊ校┐嬖谧匀灰咴吹?，嚴(yán)重危害人民健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展，1992年 WHO已將此病列為重點(diǎn)防治對象。隨著我國與世界各國貿(mào)易往來的與日俱增，出入境流動人口的逐年增加，為病原體的傳播和轉(zhuǎn)移提供了可能性，因此加強(qiáng)國境口岸的病原學(xué)檢測成為當(dāng)務(wù)之急，必須做到早發(fā)現(xiàn)，早防控，保障邊境地區(qū)的安全與穩(wěn)定。
　　目前，萊姆病的實(shí)驗(yàn)室檢查方法主要有血象分析、病原體分離、血清學(xué)和分子生物學(xué)方法，各

3、有不足。病原體分離是金標(biāo)準(zhǔn)，以病變周圍皮膚取樣陽性率最高，但耗時(shí)耗力，不是首選方法。免疫學(xué)檢測法主要有間接免疫熒光試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，快速簡便，但存在一定的假陽性和假陰性。分子生物學(xué)方法主要包括常規(guī)PCR方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有快速、敏感性高、特異性高、可定量、易于推廣的優(yōu)點(diǎn)，本研究擬建立能檢測伯氏疏螺旋體的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法并同時(shí)對菌株的基因型分型，用于國境口岸萊姆病螺旋體的快速篩查。

4、>　　目的：
　　本研究擬開展蜱媒傳染病萊姆病的監(jiān)測檢測技術(shù)研究，建立一種伯氏疏螺旋體的多重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR的快速檢測方法，可對伯氏疏螺旋體三種致病基因型伽氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體和狹義伯氏疏螺旋體檢測并同時(shí)分型。
　　方法：
　　從 Genbank中檢索伽氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體和狹義伯氏疏螺旋體的代表株的外膜蛋白o(hù)spC的全長序列，用Mega5.0軟件比對，用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)常規(guī)PCR

5、全長引物，以購自美國模式菌種保藏中心的三型標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組核酸為模板做PCR用于TA克隆構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，用作熒光定量 PCR的質(zhì)粒模板標(biāo)準(zhǔn)品。在標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的保守序列設(shè)計(jì)熒光PCR的型通用引物和型特異探針，三條探針分別標(biāo)記FAM、Texas Red和CY5熒光報(bào)告基團(tuán)，以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，分別建立及優(yōu)化伽氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體和狹義伯氏疏螺旋體的單重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法及分型多重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法，優(yōu)化反應(yīng)體系，分析其敏感性和特異性

6、，再以三型標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組核酸為模板做檢測以驗(yàn)證本方法的科學(xué)性和有效性，并初步應(yīng)用于長白口岸蜱蟲的萊姆病螺旋體的檢測。
　　結(jié)果：
　?、俳⒌馁な鲜杪菪w單重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法具有很好的靈敏性，最低檢測值為40copies/μL。②建立的阿氏疏螺旋體單重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法具有很好的靈敏性，最低檢測值為5.17copies/μL。③建立的狹義伯氏疏螺旋體單重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法具有很好的敏感性，最低檢測值為3.78

7、copies/μL。④建立的伽氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體和狹義伯氏疏螺旋體的分型多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法具有很好的靈敏性和特異性，對伽氏疏螺旋體、阿氏疏螺旋體和狹義伯氏疏螺旋體的最低檢測值分別為40 copies/μL、5.17copies/μL和38copies/μL；與蜱傳病原立克次體、土拉弗朗西斯菌均無交叉反應(yīng)，特異性佳。
　　用本實(shí)驗(yàn)所建立的伯氏疏螺旋體 TaqMan探針分型多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測2009年5月采自