幾種食源性致病菌熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、食源性致病菌引起的疾病是威脅人類健康的重要因素,也是造成人類死亡、財(cái)產(chǎn)損失的重要因?yàn)?。目?對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)主要依靠傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和免疫學(xué)分析等方法,耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣,每次只能確定或排除一種病原體,無(wú)法滿足公共安全衛(wèi)生監(jiān)控、臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查等實(shí)際需要。食源性致病菌如痢疾志賀菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、肉毒梭菌等仍然是嚴(yán)重威脅人類生命和健康的常見(jiàn)、重要食源性和傳染性致病菌。所以,為有效監(jiān)控食品、生活用水的衛(wèi)生安全,建立多重、快

2、速、有效的檢測(cè)技術(shù)十分必要。
　　 熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)是1992年由日本人Higuchi第一次提出,真正市場(chǎng)化是美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司1996年推出的qPCR儀,從而實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍。目前應(yīng)用最為廣泛、最具有應(yīng)用前景的是TaqMan探針?lè)?。該技術(shù)的基本原理是在擴(kuò)增時(shí)加入兩條寡核苷酸短鏈引物和一條雙標(biāo)記的探針。當(dāng)探針完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收。隨著PCR的進(jìn)行,當(dāng)引物延伸至探針位置時(shí),Ta

3、q酶發(fā)揮其5'→3'外切酶活性,將探針5'端的熒光分子從探針上切割下來(lái),淬滅分子失去對(duì)熒光分子的淬滅作用,從而使熒光分子發(fā)出熒光,切割的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例。
　　 許多食品基質(zhì)、培養(yǎng)基、核酸提取試劑都可能會(huì)對(duì)PCR有抑制作用,導(dǎo)致檢測(cè)敏感性顯著降低,甚至出現(xiàn)假陰性結(jié)果。通過(guò)改善樣品預(yù)處理過(guò)程來(lái)解決這種抑制現(xiàn)象,并通過(guò)一些手段對(duì)處理后的每一個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)行評(píng)估,來(lái)判斷抑制是否消除。目前,唯一能夠達(dá)到這種目的的途徑就

4、是在熒光定量PCR反應(yīng)體系中引入內(nèi)質(zhì)控(IAC),并且再加入一條能夠與IAC特異結(jié)合的標(biāo)記有另一種不同熒光基因的探針,在同一個(gè)反應(yīng)體系中,通過(guò)這兩個(gè)標(biāo)記有不同熒光染料的探針,就可以既達(dá)到定量檢測(cè)靶序列的目的,又能同時(shí)對(duì)PCR的效率或抑制現(xiàn)象進(jìn)行有效評(píng)估。
　　 本研究擬采用金黃色葡萄球菌、痢疾志賀菌、沙門氏菌、肉毒梭菌等食源性致病菌為研究對(duì)象,通過(guò)生物信息學(xué)、分子生物學(xué)等方法分析,遴選出各病原菌的特異性基因,建立幾個(gè)基于TaqM

5、an探針的多重qPCR方法,既能定量檢測(cè)致病菌特異基因信號(hào),又能同步檢測(cè)到控制假陰性的IAC信號(hào)。通過(guò)lambda噬菌體DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備研究,進(jìn)行金黃色葡萄球菌,肉毒梭菌,痢疾志賀菌,沙門氏菌等食源性致病菌基因組核酸(gDNA)定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備研究。同時(shí)將各病原菌的特異性基因克隆到相應(yīng)質(zhì)粒載體中作為其溯源的工作參考物質(zhì),然后以該工作參考物質(zhì)為基礎(chǔ),通過(guò)qPCR技術(shù)完成微生物量值溯源傳遞途徑的分析,以及模擬樣品和實(shí)際樣品特定微生物量

6、值溯源傳遞途徑的分析、評(píng)估。
　　 目的:
　　 1.通過(guò)lambda噬菌體DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的制備研究,進(jìn)行金黃色葡萄球菌,痢疾志賀菌,沙門氏菌,肉毒梭菌等食源性致病菌gDNA定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備研究。
　　 2.利用SmartCycler系統(tǒng)建立一種高敏、特異、簡(jiǎn)便、快速的qPCR檢測(cè)金黃色葡萄球菌、痢疾志賀菌、沙門氏菌、肉毒梭菌等食源性致病菌的方法,并在LightCycler 2.0,ABI 7300儀器上

7、對(duì)所建立的體系進(jìn)行評(píng)估。
　　 方法:
　　 1.以lambda噬菌體λcI857 Sam7突變株為候選物,研制用于食源性致病菌核酸量值溯源的一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
　　 2.金葡菌ATCC 6538株、痢疾菌ATCC 51197株、沙門氏菌ATCC 14028、肉毒梭菌A型62A株、B型621株、E型619株為侯選物,研制食源性致病菌核酸定值二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
　　 3.選擇金黃色葡萄球菌,痢疾志賀菌,沙門氏菌,肉

8、毒梭菌等的特異性基因保守區(qū)；用Beacon Designer 7.5設(shè)計(jì)引物和Taqman探針,將篩選出的引物及探針進(jìn)行Blast比對(duì),確定其特異性,建立檢測(cè)體系。
　　 4.對(duì)qPCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳的引物、探針濃度。
　　 5.針對(duì)金黃色葡萄球菌,痢疾志賀菌,沙門氏菌,在反應(yīng)體系中加入內(nèi)質(zhì)控IAC,并對(duì)IAC濃度進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)利用另一個(gè)標(biāo)記不同熒光基團(tuán)的Taqman探針來(lái)檢測(cè)IAC信號(hào),使體系能同時(shí)檢測(cè)IA

9、C與靶基因擴(kuò)增。
　　 6.針對(duì)肉毒梭菌A/B/E三型,建立三重qPCR反應(yīng),能在一個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)檢測(cè)到這三種不同型的肉毒梭菌。
　　 7.收集61株近源或食品相關(guān)病原菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)體系的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 8.選取上述6種病原菌定量檢測(cè)靶序列的兩端序列,用Palmer palmer 5.0設(shè)計(jì)合成引物,擴(kuò)增含靶序列的片段,連接入pMD18-T載體,構(gòu)建工作參考物重組質(zhì)粒,并用EcoRI酶切線性化,用EASY

10、 Dilution液稀釋制成標(biāo)準(zhǔn)模板溶液,構(gòu)建工作參考物標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　 9.分別以10倍梯度稀釋的工作參考物重組質(zhì)粒、純化的gDNA,菌落計(jì)數(shù)菌液10倍梯度稀釋液提取的gDNA為模板,對(duì)反應(yīng)體系的靈敏度進(jìn)行評(píng)估。
　　 10.用金葡菌ATCC 6538株、痢疾菌ATCC 51197株、沙門氏菌ATCC 14028株污染飲用水和牛奶,用肉毒梭菌A型62A株、B型621株、E型619株污染牛奶來(lái)模擬實(shí)際樣本,采用該體系來(lái)檢

11、測(cè)模擬樣本以評(píng)價(jià)體系的性能。
　　 11.選擇LightCycler 2.0和ABI 7300等兩款熒光定量PCR儀對(duì)所建立的體系進(jìn)行評(píng)估驗(yàn)證。
　　 結(jié)果:
　　 1.通過(guò)對(duì)不同方法提取lambda噬菌體DNA進(jìn)行比較,最終選取用QIAGEN公司的LDNA提取試劑盒提取純化得到LDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))。并經(jīng)酶切鑒定、PCR鑒定以及測(cè)序鑒定,最終都表明所提取的DNA為lambda噬菌體突變株λC1857

12、Sam 7株的DNA。
　　 2.通過(guò)對(duì)兩種不同試劑盒提取細(xì)菌gDNA進(jìn)行比較,最終選取用北京TIAGEN生化科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌gDNA,制備食源性致病菌核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))。
　　 3.利用上述61株標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)證本體系特異性,結(jié)果僅目的菌的靶基因有特異性擴(kuò)增,其他細(xì)菌均無(wú)擴(kuò)增,即沒(méi)有擴(kuò)增信號(hào)出現(xiàn),顯示體系是100％特異的。無(wú)論目的基因是否有擴(kuò)增,內(nèi)質(zhì)控IAC擴(kuò)增的JOE熒光均出現(xiàn)陽(yáng)

13、性信號(hào)(針對(duì)金葡、痢疾、沙門菌),Ct為33個(gè)循環(huán)左右。
　　 4.建立的工作參考物線性質(zhì)粒定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值與模板拷貝數(shù)呈良好的線性關(guān)系(r2≥0.999),曲線斜率接近于理論值-3.32,由斜率得出的PCR效率E>90％。
　　 5.以含靶基因片段的線性質(zhì)粒作為模板,針對(duì)金葡菌、痢疾菌、沙門菌等,反應(yīng)體系的靈敏度最低可達(dá)到2拷貝/反應(yīng)體系(金葡菌)、10拷貝/反應(yīng)體系(痢疾菌)、5拷貝/反應(yīng)體系(沙門菌)；針對(duì)肉毒梭

14、菌A/B/E三重PCR,最低分別能檢測(cè)到5拷貝/反應(yīng)體系(A型)、2拷貝/反應(yīng)體系(B型)、5拷貝/反應(yīng)體系(E型)的線性質(zhì)粒；以gDNA為模板,最低均能檢測(cè)到10fg/反應(yīng)體系。
　　 6.用涂平板法計(jì)數(shù)并10倍梯度稀釋的菌液提取的gDNA為模板,最低能檢測(cè)到5.0×101 cfu/ml(金葡菌)、2.74x101cfu/ml(痢疾菌)、1.41×101cfu/ml(沙門菌),2.11×101cfu/ml(肉毒A型)、1.02

15、x101 cfu/ml(肉毒B型)、5.38x101cfu/ml(肉毒E型)的細(xì)菌細(xì)胞。
　　 7.針對(duì)模擬飲用水樣,最低分別能檢測(cè)到5.0×101cfu/25ml水樣(金葡菌)、2.74x101cfu/25ml水樣(痢疾菌)、1.41×101 cfu/25ml水樣(沙門菌)的細(xì)菌細(xì)胞。
　　 8.針對(duì)模擬牛奶樣,最低分別能檢測(cè)到5.0×102 cfu/25ml牛奶樣(金葡菌)、2.74x102 cfu/25ml牛奶樣(

16、痢疾菌)、1.41×102 cfu/25ml牛奶樣(沙門菌)、2.11×10225cfu/ml牛奶樣(肉毒A型)、1.02x102 cfu/25ml牛奶樣(肉毒B型)、5.38x102cfu/25ml牛奶樣(肉毒E型)的細(xì)菌細(xì)胞。
　　 9.所建立的qPCR體系,在SmartCycler、LightCycler 2.0、ABI7300等這三款不同廠家、不同型號(hào)的儀器上都能得到較好的結(jié)果,完全適用于這些不同的熒光定量PCR儀。

17、r>　　 結(jié)論:
　　 1.國(guó)內(nèi)首次提出了研究食源性致病菌gDNA的含量測(cè)量溯源路線,并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備、定值進(jìn)行了探索。
　　 2.本研究所建立的針對(duì)金黃色葡萄球菌,痢疾志賀菌,沙門氏菌的qPCR檢測(cè)方法,具有IAC,既能定量檢測(cè)食物傳播病原體,又能監(jiān)測(cè)PCR體系以防止假陰性發(fā)生或低估病原菌污染量,對(duì)食源菌診斷研究領(lǐng)域又是一個(gè)補(bǔ)充。
　　 3.本研究建立了檢測(cè)金黃色葡萄球菌、痢疾志賀氏菌、沙門氏菌以及肉毒A/