自身淬滅熒光定量PCR檢測SARS冠狀病毒方法的建立.pdf

1、　　目的：應用新型的自身淬滅熒光引物(LUXPrimer)原理及技術(shù)，建立一種快速、特異、敏感和準確的定量檢測SARS冠狀病毒RNA的實時熒光定量RT-PCR方法?！　》椒ǎ焊鶕?jù)已公布的SARS冠狀病毒全基因序列，利用BLAST，Clustalx，RNAstructure等軟件分析得到PCR擴增的靶序列。應用LUXTMDesigner軟件設(shè)計引物，借助計算機輔助，分析其保守性和特異性并進行優(yōu)化。通過TA克隆，將靶序列的cDNA克隆到到

2、pGEM-T載體上，應用SP6RNA聚合酶經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄得到靶序列，作為RT-PCR反應體系優(yōu)化和評價實驗的模板。對RT-PCR反應體系中的Mg2+，dNTP和引物濃度進行優(yōu)化。將體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA作為模板，對方法的靈敏度，定量線性范圍，精密度等進行評價。　　結(jié)論：本實驗建立的自身淬滅實時熒光定量RT-PCR能夠快速，準確，敏感地對SARS冠狀病毒核酸進行定量分析，具有較大的定量范圍。有望為臨床SARS冠狀病毒基因的早期定量檢測提供一種