蛋白酶體抑制劑聯(lián)合阿霉素誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的] 近年來,淋巴瘤的臨床治療主要采用化療、放療及造血干細(xì)胞移植.隨著對腫瘤發(fā)生分子機(jī)制的認(rèn)識,淋巴瘤靶向治療已成為一種新的治療模式,目前淋巴瘤靶向治療主要包括單克隆抗體、放射免疫治療、特異性酶抑制劑、腫瘤疫苗等.PS-341是首個進(jìn)行臨床研究的蛋白酶體抑制劑,已應(yīng)用于治療多發(fā)性骨髓瘤及部分非霍奇金淋巴瘤.本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步研究PS-341對淋巴瘤的抗腫瘤作用,以霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株L428及T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat為實(shí)驗(yàn)對象,觀

2、察PS-341對淋巴瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用及其可能機(jī)制,同時觀察PS341聯(lián)合阿霉素對淋巴瘤細(xì)胞是否具有協(xié)同作用,為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù). [方法] 1.采用MTT比色法檢測PS-341對人淋巴瘤細(xì)胞株L428和Jurkat體外生長的抑制作用. 2.瑞氏-姬姆薩(Wright-Giemsa)染色,油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài). 3.應(yīng)用流式細(xì)胞儀,Annexin V和PI雙染色,周期分析檢測細(xì)胞凋亡. 4.W

3、estem-blot法檢測對L428和Jurkat細(xì)胞Bcl-2,Bax,Caspase8,Caspase3和PARP蛋白表達(dá)水平的影響. 5.采用MTT比色法檢測PS341聯(lián)合阿霉素作用下,L428和Jurkat細(xì)胞株對PS-341的敏感性變化. [結(jié)果] 1.PS-341抑制淋巴瘤細(xì)胞的生長,呈濃度依賴性 MTT比色法檢測結(jié)果顯示,PS341或阿霉素處理L428及Jurkat細(xì)胞24h、48h、72h

4、,都能夠明顯抑制細(xì)胞增殖,且生長抑制率與藥物作用濃度呈正相關(guān),呈濃度依賴性,PS341與阿霉素處理L428細(xì)胞24h、48h、72h后的IC<,50>分別為391.82ng/ml、173.86 ng/ml、49.9 ng/ml和1955.56ng/ml、464.93 ng/ml、74.77ng/ml;PS341與阿霉素處 Jurkat 胞24h、48h、72h后的IC<,50>分別為137.64ng/ml、69.50 ng/ml、31.

5、23 ng/ml和471.38ng/ml、226.57 ng/ml、72.58 ng/ml. 2.PS-341誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡,呈濃度依賴性 采用瑞氏-姬姆薩染色,油鏡下觀察PS341作用L428及Jurkat前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征.以流式細(xì)胞分析技術(shù)研究了細(xì)胞DNA含量、亞二倍體及磷脂酰絲氨酸(PS)轉(zhuǎn)位.結(jié)果顯示,PS-341作用L428及Jurkat細(xì)胞24hr,細(xì)胞凋亡率與藥物作用濃度呈正

6、相關(guān). 3.PS-341對L428和Jurkat細(xì)胞Bcl-2,Bax,Caspase8,Caspase3和PARP蛋白表達(dá)水平的影響 PS341作用L428細(xì)胞后,隨濃度的增加,Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào),而Bax蛋白表達(dá)上調(diào);而Caspase3,Caspase8和PARP蛋白都出現(xiàn)明顯的剪切帶.PS34-1作用Jurkat細(xì)胞后Caspase8,Caspase3和PARP蛋白均出現(xiàn)明顯的剪切帶;而Bcl-2與Bax蛋白表

7、達(dá)無改變. 4.阿霉素增強(qiáng)L428和Jurkat細(xì)胞對PS-341的敏感性 分別以遠(yuǎn)低于IC50劑量的阿霉素單獨(dú)或聯(lián)合PS341處理L428和Jurkat細(xì)胞24小時, MTT結(jié)果顯示,在一定濃度范圍內(nèi)PS341聯(lián)合阿霉素組生長抑制率大于PS341與阿霉素單藥組作用下的抑制率之和;流式細(xì)胞儀分析顯示PS341聯(lián)合阿霉素組細(xì)胞凋亡率大于PS341與阿霉素單藥組作用下的細(xì)胞凋亡率之和. [結(jié)論] 1.在體外,

8、PS-341可直接抑制淋巴瘤細(xì)胞L428和Jurkat的生長,呈濃度依賴性;其抑制作用與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān). 2.對L428細(xì)胞,PS341能下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)水平,上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)水平,改變Bcl-2家族抗凋亡因子和促凋亡因子的表達(dá)比例,同時Caspase8蛋白出現(xiàn)明顯的剪切激活帶,其誘導(dǎo)凋亡機(jī)制既與線粒體途徑又與外源性途徑有關(guān);而對于Jurkat細(xì)胞,PS341作用后Caspase8蛋白也出現(xiàn)明顯的剪切激活帶,通過外