EPCs聯(lián)合MSCs作為組織工程心臟瓣膜種子細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：獲取理想種子細(xì)胞——具有相應(yīng)功能的自體活性細(xì)胞，是目前TEHV研制的重點(diǎn)，尋找一條便捷、有效的獲取種子細(xì)胞的方法，并完善內(nèi)皮化，是構(gòu)建TEHV的核心問(wèn)題。本課題取材骨髓，分離得到內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，體外培養(yǎng)、擴(kuò)增、分化，種植于去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣支架材料，進(jìn)行構(gòu)建TEHV實(shí)驗(yàn)研究，探討EPCs聯(lián)合MSCs構(gòu)建TEHV的可行性和條件，為新型組織工程心臟瓣膜種子細(xì)胞的選擇提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：

2、 1.采用免疫磁珠和貼壁換液兩種方法，分離得到EPCs和MSCs，進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增、分化、鑒定及一般生物學(xué)特性研究：①內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，纖維粘連蛋白包被培養(yǎng)皿，以EGF、IGF-1、VEGF等生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)EPCs分化，采用免疫組化CD31、Ⅷ因子相關(guān)抗原染色、流式細(xì)胞儀與電鏡鑒定，以荊豆凝集素吸收試驗(yàn)(UEA-1)、乙?；兔芏戎鞍?DiI-Ac-LDL)攝取試驗(yàn)以及合成分泌NO評(píng)價(jià)內(nèi)皮細(xì)胞功能；同時(shí)，在EPCs培養(yǎng)中加入他

3、汀類(lèi)藥物，觀察EPCs增殖和遷移情況。②DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)擴(kuò)增，以5-Aza誘導(dǎo)MSCs分化，采用α-SMA、Vimentin免疫組化染色鑒定其分化表達(dá)，以免疫組化Ⅰ、Ⅲ膠原染色評(píng)價(jià)其分泌功能。③通過(guò)對(duì)獲得EPCs細(xì)胞數(shù)量和純度的分析，比較免疫磁珠和貼壁換液兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。 2.采用改變滲透壓和酶消化的方法制備去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣支架，將分化后的MSCs和EPCs序貫式種植于支架材料，置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，靜態(tài)構(gòu)建TEHV。培養(yǎng)30天

4、后取出，通過(guò)石蠟包埋切片HE染色，免疫組織化學(xué)染色和電鏡觀察，評(píng)價(jià)TEHV的組織學(xué)結(jié)構(gòu)，考察種子細(xì)胞的粘附生長(zhǎng)情況。 結(jié)果： 1.從骨髓中可以分離得到EPCs和MSCs。原代培養(yǎng)的MSCs呈多角形或梭形，4-7天后呈集落樣生長(zhǎng)，其α-SMA、Vimentin和Ⅰ、Ⅲ膠原免疫組化染色染色呈陽(yáng)性，提示可以分化為肌纖維細(xì)胞；超微結(jié)構(gòu)胞漿內(nèi)含有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及分泌小泡，提示具有旺盛的分泌功能。內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)的EPCs呈短梭形

5、及多角形，12d后呈鋪路石樣生長(zhǎng)，表達(dá)CD31、Ⅷ因子相關(guān)抗原，UEA-1結(jié)合試驗(yàn)和DiI-Ac-LDL吸收試驗(yàn)陽(yáng)性，超微結(jié)構(gòu)顯示細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)Weibel-Palade小體。 2.采用免疫磁珠和貼壁換液兩種方法，均可分離得到較高純度的EPCs和MSCs。免疫磁珠法分離所得EPCs純度更高，為76％，但方法復(fù)雜，費(fèi)用高。人骨髓MSCs有很強(qiáng)貼壁能力，培養(yǎng)開(kāi)始24小時(shí)內(nèi)有90％左右貼壁生長(zhǎng)，通過(guò)逐次貼壁培養(yǎng)，將幾乎全部成纖維細(xì)胞和大部

6、分巨噬細(xì)胞去除。以貼壁換液法懸液離心繼續(xù)培養(yǎng)，可獲得EPCs，其純度為29％，此方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用。 3.EPCs和MSCs通過(guò)體外擴(kuò)增可達(dá)到細(xì)胞種植所需數(shù)量。MSCs呈指數(shù)增殖，10ml骨髓液分離得到的MSCs體外培養(yǎng)14d可獲得2×108數(shù)量細(xì)胞，足以滿足構(gòu)建TEHV時(shí)細(xì)胞種植的需要；EPCs細(xì)胞含量少，但在內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，纖維粘連蛋白包被培養(yǎng)皿，以及EGF、IGF-1、VEGF等生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)下，聯(lián)合他汀類(lèi)藥物進(jìn)行

7、動(dòng)員擴(kuò)增，在體外培養(yǎng)21d可獲得5×107數(shù)量細(xì)胞，也能夠滿足構(gòu)建TEHV時(shí)細(xì)胞種植的需要。 4.采用改變滲透壓和酶消化的方法制備去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣支架，細(xì)胞成分被充分去除，支架材料的力學(xué)強(qiáng)度、理化性能、組織相容性好；種子細(xì)胞采用序貫式種植(先種植MSCs，后種植EPCs)和間隔36h反復(fù)多次接種的方法可增強(qiáng)細(xì)胞粘附性并提高種子細(xì)胞的接種率。 5.對(duì)靜態(tài)構(gòu)建的組織工程瓣葉檢測(cè)：誘導(dǎo)后種植的MSCs向成肌纖維細(xì)胞分化，所構(gòu)建

8、的TEHV瓣葉間質(zhì)中Ⅰ、Ⅲ型膠原含量明顯增加，表明種植的MSCs生長(zhǎng)良好，并具有分泌膠原的功能。與單純MSCs種植組比較，在聯(lián)合種植組中，其細(xì)胞種類(lèi)更全，EPCs細(xì)胞也能增殖，粘附TEHV表面形成內(nèi)皮細(xì)胞層，并表達(dá)Ⅷ因子相關(guān)抗原，同時(shí)，掃描電鏡顯示去細(xì)胞支架表面被內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋，表面光滑。試驗(yàn)中還將體外構(gòu)建的TEHV瓣葉與天然的豬主動(dòng)脈瓣腋進(jìn)行比較，在生物學(xué)強(qiáng)度方面沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果初步說(shuō)明，EPCs聯(lián)合MSCs作為T(mén)EHV種子細(xì)胞

9、所構(gòu)建的組織工程心臟瓣膜在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生物學(xué)強(qiáng)度上與正常瓣膜具有相似性，應(yīng)用此組織工程技術(shù)體外構(gòu)建組織工程心臟瓣膜是可行的。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)采用免疫磁珠和貼壁換液兩種方法，均可從骨髓中分離得到內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)和間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，免疫磁珠法分離所得EPCs純度高、數(shù)量大，方法復(fù)雜、費(fèi)用高；以貼壁換液法懸液離心繼續(xù)培養(yǎng)，獲得EPCs純度低、數(shù)量小，方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用。骨髓中分離培養(yǎng)EPCs，其形態(tài)與細(xì)胞表面標(biāo)記等與文獻(xiàn)

10、報(bào)道基本符合，通過(guò)CD31、Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化，UEA-1結(jié)合試驗(yàn)和DiI-Ac-LDL吸收試驗(yàn)以及透射電鏡等鑒定，具有分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的能力。同時(shí)，分離得到MSCs，通過(guò)α-SMA、Vimentin以及Ⅰ、Ⅲ膠原免疫組化等鑒定，具有分化為成熟肌纖維細(xì)胞的能力。骨髓來(lái)源MSCs和EPCs具有分化成間質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞能力，通過(guò)體外生長(zhǎng)因子刺激和動(dòng)員擴(kuò)增可達(dá)到細(xì)胞種植所需數(shù)量，同時(shí)具有許多優(yōu)點(diǎn)：骨髓取材方便，體外培養(yǎng)擴(kuò)增后可以獲得大量