RGD交聯(lián)去細胞牛心包構建組織工程心臟瓣膜支架的實驗研究.pdf

1、我國是風濕性心臟病的高發(fā)國家，每年至少有10萬例患者需要瓣膜置換?，F(xiàn)有的人造心臟瓣膜存在著缺陷：機械瓣需終生抗凝，容易發(fā)生出血及血栓栓塞并發(fā)癥；生物瓣由于組織退行性變、鈣化而導致瓣膜衰壞和功能障礙。因此，具有生長能力和修復功能的組織工程心臟瓣膜（tissueengineeredheartvalves,TEHV）成為研究的方向和熱點。
　　理想的支架材料是構建具有生物活性功能TEHV至關重要的問題，其應當具有良好的生物力學性能和組織

2、相容性。目前國內外還未有理想的TEHV，主要的一個問題就在于尚沒有理想的TEHV支架材料。已有的支架材料存在各自缺陷：合成材料由于機械強度不足，缺乏ECM成份及適合的可降解性等問題，未有成功應用的報道；生物支架保存了較完整的細胞外基質（extracellularmatrix，ECM）成份，同時有良好的機械性能而具有獨特優(yōu)勢，但也存在細胞黏附及在支架內部生長困難等問題。如何克服材料固有缺陷，改良出符合TEHV要求的支架，是目前國內外研究的

3、重點。
　　牛心包(bovinepericardium，BP)是一種取材方便，臨床應用廣泛的生物材料，本課題針對牛心包生物材料，改進處理方法，采用胰酶+TritonX-100法去除牛心包細胞成份，觀察了不同去細胞時間對材料組織學、生物力學性能的影響；并采用乙酸（aceticacid，AA）對去細胞牛心包（acellularbovinepericardium，ABP）進一步改良，提高材料孔徑及孔隙率，同時首先在生物材料表面共價交聯(lián)R

4、GD多肽，進一步增加對種子細胞黏附、遷移及增殖的影響；同時體外培養(yǎng)、鑒定人骨髓間充質干細胞（humanmesenchymalstemcells，hMSCs），并進行RGD多肽對hMSCs生物學功能影響實驗；將改良后的ABP支架材料進行體外hMSCs種植實驗，進一步對乙酸處理、RGD多肽交聯(lián)的改良ABP作為TEHV支架材料的可行性進行探討與研究。
　　第一部分：采用我們研究組過去首先應用的胰酶+TritonX-100，結合DNA酶與

5、RNA酶去細胞方法進行BP去細胞處理，對不同TritonX-100處理時間的去細胞效果，ABP的結構特點、力學性能進行對照研究。結果提示采用胰酶+TritonX-100方法，可以完全脫除牛心包內細胞成份。TritonX-100高、低滲溶液去細胞處理8h組在完全去除細胞成份的基礎上，能保持膠原纖維形態(tài)結構和排列，其力學性能較BP有明顯下降，但最大拉伸強度（Maximumtensilestrength，Tmax）仍保持在12.61±0.64

6、MPa的較高水平。說明經過適合時間胰酶+TritonX-100去細胞處理得到的ABP支架具有較好的生物相容性及力學強度，符合組織工程瓣支架材料的基本要求。
　　第二部分：采用AA對ABP進一步改良，提高材料孔徑及孔隙率，同時我們首先在材料表面共價交聯(lián)RGD多肽，以期進一步增加對種子細胞黏附、遷移及增殖的影響。結果顯示：AA處理ABP材料，使材料的孔陘及孔隙率明顯提高（162.2±24.3um，94.7±1.8％，p＜0.01），相

7、比膠原酶處理，AA處理能在提高材料孔徑及孔隙率的基礎上保持較好的膠原纖維排列和力學強度（Tmax=9.93±0.82MPa）；通過EDC/NHS共價交聯(lián)RGD多肽，可以在ABP材料表面大量牢固結合RGD多肽。以上實驗結果將為種子細胞在支架材料上的黏附、遷移和增殖創(chuàng)造良好的條件。
　　第三部分：分離培養(yǎng)、鑒定hMSCs，并通過膠原膜黏附實驗初步觀察RGD多肽對hMSCs生物學性能的影響。結果表明：通過通過密度梯度離心法、貼壁篩選法可

8、成功分離出hMSCs；采用10％胎牛血清（fetalcalfserum，F(xiàn)CS）/DMEM培養(yǎng)體系對hMSCs體外培養(yǎng)、擴增順利；流式細胞儀檢測3-7代（P3-7）hMSCs表面標志：CD73、CD105、CD166、CD90及CD44(粘附分子，基質細胞表達)為陽性；CD34、CD31及CD45持續(xù)陰性，說明本實驗培養(yǎng)的細胞具備MSC的表面標記特點，細胞成分均一，純度在98％以上，具有高度的同源性；體外RGD交聯(lián)膠原膜，明顯增加hMS

9、Cs的黏附，加快細胞骨架合成，說明以RGD多肽交聯(lián)ABP為支架可能大大增強hMSCs的黏附、遷移及增殖。
　　第四部分：將改良后的ABP支架材料進行體外hMSCs種植實驗，結果顯示：與單純去細胞處理（ABP）、AA處理（AA）及RGD多肽交聯(lián)（RGD）的ABP相比，hMSCs黏附數(shù)量明顯增多，種植10天后在AA處理同時有RGD多肽交聯(lián)的ABP（RGD-AA）材料孔隙內hMSCs生長和增殖良好，并分泌ECM成份。表明AA處理聯(lián)合RG

10、D交聯(lián)可以大大增強hMSCs黏附，提高細胞生長活性，同時hMSCs可以在材料內部順利生長。說明AA處理聯(lián)合RGD交聯(lián)的ABP材料具有作為TEHV支架材料具有良好應用前景。
　　結論:本實驗進一步證實我們研究組過去應用的通過胰酶（2h）+TritonX-100（高、低滲溶液各8h）方法去細胞處理，可以完全去除新鮮牛心包內的細胞成份，并顯著降低材料內可溶性蛋白，大大降低了材料的免疫原性；同時材料保持了良好的力學性能；牛心包材料具有力學

11、的各向異性，其纖維走向對力學性能有明顯影響，沿平行纖維走向的力學性能最強。乙酸處理可以明顯提高去細胞牛心包材料的孔徑及孔隙率，克服了以往生物材料低孔徑、孔隙率的缺點，同時還保留了材料較好的機械性能。采用的密度梯度離心和貼壁分離法分離hMSCs，以10％FCS/DMEM培養(yǎng)體系培養(yǎng)，在多次傳代后hMSCs增殖能力強，細胞形態(tài)趨于一致，表型穩(wěn)定。我們首先應用RGD多肽通過EDC/NHS法大量牢固結合于去細胞牛心包表面，實驗表明，RGD可以明