PEG納米微球改性去細(xì)胞瓣構(gòu)建組織工程心臟瓣膜的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 丙烯?；姆种垡叶技{米微球合成
　　 第一節(jié) 不同分子量4-Arm PEG-Ac合成和鑒定
　　 目的：合成三種分子量丙烯酰化四分枝聚乙二醇（4-Arm polyethylene glycol-Acrylate,4-Arm PEG-Ac）。
　　 方法:以不同分子量四分枝聚乙二醇（4-Arm polyethylene glycol,4-Arm PEG）和丙烯酰氯為原料，通過(guò)酯化反應(yīng)合成MW2,000

2、Da、5,000Da及20,000Da三種分子量4-Arm PEG-Ac。應(yīng)用1H核磁共振、高效液相色譜、基質(zhì)輔助激光解吸電離、凝膠過(guò)濾色譜法鑒定該聚合物。
　　 結(jié)果：所合成聚合物純度高，分子量與設(shè)計(jì)相符，多分散性和置換度都達(dá)到要求。
　　 結(jié)論：三種不同分子量多聚物都可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 第二節(jié) 不同納米微球合成和比較
　　 目的：合成三種分子量4-Arm PEG-Ac納米微球，并選擇最合適的一種

3、納米微球進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
　　 方法:以乳化交聯(lián)法合成納米微球，通過(guò)產(chǎn)率計(jì)算、透射電鏡、Zeta電位分析儀比較三種納米微球。
　　 結(jié)果：三種微球粒徑范圍都在20nm左右，由4-Arm PEG-Ac(MW20,000Da)所合成的納米微球產(chǎn)率最高、形態(tài)最好、粒徑最均一、分散相最多。
　　 結(jié)論：本次試驗(yàn)成功合成了三種納米微球，以4-Arm PEG-Ac(MW20,000Da)為原料合成的納米微球最適合進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

4、
　　
　　 第二部分 納米微球改性去細(xì)胞瓣構(gòu)建復(fù)合支架
　　 第一節(jié) 納米微球改性去細(xì)胞瓣構(gòu)建復(fù)合支架
　　 目的：構(gòu)建納米微球復(fù)合支架，并證明其微觀結(jié)構(gòu)穩(wěn)定可靠。
　　 方法:以碳二亞胺鹽酸鹽（1-Ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC.HCL）為交聯(lián)劑，將納米微球與去細(xì)胞瓣交聯(lián)，制備納米微球復(fù)合支架。對(duì)納

5、米微球復(fù)合支架進(jìn)行HE染色觀察、掃描電鏡觀察、三硝基苯磺酸（trinitro-benzene-sulfonic acid,TNBS）法檢測(cè)自由氨基變化、湍流反應(yīng)器檢測(cè)支架穩(wěn)定性。
　　 結(jié)果：電鏡下支架表面布滿(mǎn)納米微球，TNBS法發(fā)現(xiàn)納米微球復(fù)合支架自由氨基較單純?nèi)ゼ?xì)胞瓣明顯減少，在湍流應(yīng)力場(chǎng)作用2天后復(fù)合支架微觀結(jié)構(gòu)仍然保持。
　　 結(jié)論：成功地構(gòu)建了納米微球復(fù)合支架，其微觀結(jié)構(gòu)穩(wěn)定可靠,納米微球與去細(xì)胞瓣的結(jié)合是牢固

6、的化學(xué)鍵合。
　　 第二節(jié) 納米微球復(fù)合支架相關(guān)生物學(xué)性能研究
　　 目的：研究納米微球復(fù)合支架生物相容性、控釋特性及生物力學(xué)性能。
　　 方法：皮下包埋法研究納米微球復(fù)合支架生物相容性，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)研究其對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）的控釋能力，拉伸試驗(yàn)研究其

7、生物力學(xué)性能。
　　 結(jié)果：納米微球復(fù)合支架皮下包埋實(shí)驗(yàn)炎癥反應(yīng)輕，該支架對(duì)TGF-β1包封率約為72％，從第12小時(shí)開(kāi)始，表現(xiàn)出對(duì)TGF-β1明顯控釋?zhuān)撝Ъ茏畲髴?yīng)力及彈性模量高于天然瓣膜和去細(xì)胞瓣膜，維持最大應(yīng)變的能力優(yōu)于去細(xì)胞瓣膜。
　　 結(jié)論：構(gòu)建的納米微球復(fù)合支架具有良好的生物相容性，對(duì)于TGF-β1具有良好的包封和控釋特性，生物力學(xué)性能優(yōu)良。
　　 第三部分 納米微球復(fù)合支架構(gòu)建組織工程心臟瓣膜

8、>　　 目的：鑒定原代培養(yǎng)肌成纖維細(xì)胞，證明包封有TGF-β1的納米微球復(fù)合支架+肌成纖維細(xì)胞（Myofibroblasts，MFBs）體外靜態(tài)培養(yǎng)方法能構(gòu)建性能優(yōu)良的組織工程心臟瓣膜（tissue engineering heart valve,TEHV）。
　　 方法：原代培養(yǎng)MFBs，直接光鏡觀察和免疫組化法鑒定，羥脯氨酸試劑盒檢測(cè)TEHV膠原含量，拉伸試驗(yàn)檢測(cè)TEHV力學(xué)性能。
　　 結(jié)果：光鏡及免疫組化結(jié)果證