載BMP2活性肽的羧基化氧化石墨烯-煅燒骨三維多孔材料的制備及成骨活性研究.pdf

1、第一部分羧基化氧化石墨烯/煅燒骨的制備及理化性質的研究
　　目的探討羧基化氧化石墨烯/煅燒骨的制備方法，并評價其理化性質。
　　方法通過改良Hummers法制備氧化石墨烯(GO)，并將氧化石墨烯羧基化以制備羧基化氧化石墨烯(CGO)，采用傅里葉紅外光譜儀(FTIR)和X射線光電子能譜(XPS)對制備的CGO進行鑒定。制備0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml的CGO懸浮液，將邊長為5mm的煅燒骨(TBC)立方體浸入懸浮

2、液中，通過超聲復合2h和6h，分別制備0.5mg/ml-2h、1mg/ml-2h、2mg/ml-2h、1mg/ml-6h、2mg/ml-6h五種不同的羧基化氧化石墨烯/煅燒骨(CGO-TBC)。每個樣品采用三維視頻顯微鏡和場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)評價CGO在TBC材料表面的分布情況及CGO-TBC的表面形貌，選取最佳復合濃度和時間的CGO-TBC，并與TBC材料作比較測定其孔徑、孔隙率、抗折壓強度。
　　結果通過FTIR和X

3、PS檢測，表明氧化石墨烯已成功羧基活化。三維視頻顯微鏡和SEM對比五種不同CGO-TBC，選取1mg/ml-6h的CGO-TBC具有最佳CGO分布及表面納米形貌。CGO-TBC的孔隙率和孔隙大小與TBC無明顯差別，CGO-TBC的抗壓和抗折強度較TBC更高。
　　結論本實驗成功制備CGO，并且TBC在1mg/ml的CGO懸浮液中超聲復合6h可獲得最佳CGO分布和材料表面形貌的CGO-TBC，CGO-TBC具有良好的表面形貌和孔隙結

4、構，具有更好的生物力學強度。
　　第二部分羧基化氧化石墨烯/煅燒骨的生物相容性以及載BMP2活性多肽pBMP2后體外控釋的研究
　　目的評價CGO-TBC的生物相容性，并負載BMP2活性多肽pBMP2以評價其在體外的藥物釋放動力學。
　　方法制備 CGO-TBC材料浸提液，采用浸提液進行急性毒性實驗、微核實驗、局部皮膚刺激實驗、熱原檢查實驗、溶血實驗，并將材料植入肌袋進行肌袋植入實驗，在 CGO-TBC表面接種 MC3

5、T3-E1細胞，通過鈣黃綠素/碘化丙啶染色，熒光顯微鏡下觀察并評價材料的細胞相容性。將 TBC和CGO-TBC分別負載 BMP2活性多肽pBMP2，評價pBMP2在兩種支架材料中的藥物釋放動力學。
　　結果急性毒性實驗未見大鼠大體觀及臟器有明顯異常，微核實驗檢測陰性，局部皮膚刺激未見明顯水腫紅斑，熱原檢查實驗符合標準，溶血實驗陰性，肌袋植入實驗可見材料周圍形成完整的纖維包膜，熒光顯微鏡下觀察MC3T3-E1細胞存活良好，形態(tài)和分布

6、正常。體外釋放實驗表明pBMP2在CGO-TBC內釋放更加緩慢。
　　結論 CGO-TBC生物相容性良好，體外釋放pBMP2較TBC材料更為緩慢，適宜作為一種骨修復支架材料和緩釋藥物載體。
　　第三部分羧基化氧化石墨烯/煅燒骨對MC3T3-E1細胞的形態(tài)、粘附以及負載pBMP2后對細胞增殖、分化的影響
　　目的評價CGO-TBC與TBC對MC3T3-E1細胞粘附率、形態(tài)分布的影響，并負載pBMP2和rhBMP2后評價其

7、對MC3T3-E1細胞增殖和成骨分化的影響
　　方法將小鼠前成骨細胞MC3T3-E1種植在TBC和CGO-TBC表面，鈣黃綠素/碘化丙啶染色后激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、分布等情況，多聚甲醛固定后在場發(fā)射掃描電子顯微鏡下觀察其在材料表面的形態(tài)和分布情況。通過間接計數(shù)法檢測細胞在CGO-TBC和TBC表面的粘附率情況。將3mg的pBMP2或1μ g的rhBMP2負載在TBC和CGO-TBC表面，實驗分為TBC組、CGO-TBC組

8、、pBMP2/TBC組、pBMP2/CGO-TBC組、rhBMP2/TBC組、rhBMP2/CGO-TBC組，將MC3T3-E1細胞種植在材料上，采用MTT法檢測MC3T3-E1細胞在不同材料上的增殖活性，通過檢測堿性磷酸酶(ALP)活性來評價MC3T3-E1細胞在不同材料上的成骨分化活性
　　結果鈣黃綠素/碘化丙啶染色后在激光共聚焦顯微鏡下觀察，可見 TBC和CGO-TBC上的MC3T3-E1細胞形態(tài)正常，CGO-TBC上的細胞

9、鋪滿支架小梁，排列較為有序。掃描電鏡下觀察可見細胞在小梁凹陷處分布較多，CGO-TBC上的細胞較TBC的細胞立體結構更為飽滿。粘附率測定顯示，CGO-TBC對細胞粘附率顯著高于TBC組。MTT增殖和ALP活性測定顯示，pBMP2能有效促進MC3T3-E1的增殖和成骨分化，CGO-TBC較TBC對細胞的增殖和分化具有一定的促進作用。
　　結論 CGO-TBC材料較TBC材料對細胞的形態(tài)、粘附具有一定的有利影響，在負載 pBMP2后能

10、作為一種骨誘導材料影響 MC3T3-E1細胞的增殖和成骨分化，pBMP2可發(fā)揮類似BMP2的骨誘導作用。
　　第四部分羧基化氧化石墨烯/煅燒骨負載pBMP2修復大鼠顱骨缺損模型的實驗研究
　　目的進一步評價pBMP2和CGO-TBC在大鼠顱骨臨界骨缺損模型中修復骨缺損的能力和效果，探討其在體內環(huán)境中對骨缺損修復的可行性和療效。
　　方法將TBC和CGO-TBC負載3mg的pBMP2或1μ g的rhBMP2，植入大鼠顱骨

11、臨界骨缺損模型中觀察成骨情況。實驗分為6組：TBC組、CGO-TBC組、pBMP2/TBC組、pBMP2/CGO-TBC組、rhBMP2/TBC組、rhBMP2/CGO-TBC組。將24只大鼠隨機分為6組，制備直徑5mm的大鼠顱骨臨界骨缺損模型并植入上述材料，12W后行大體觀、X線檢查、CT三維重建和組織學切片HE染色評價骨缺損修復情況。
　　結果12W后，TBC組和CGO-TBC組材料與宿主骨之間界限明顯，材料大小無明顯改變，C

12、T三維重建顯示缺損處凹陷明顯，HE染色提示TBC組無明顯新骨形成，CGO-TBC組在宿主骨邊緣有少量新骨形成；pBMP2/TBC組和pBMP2/CGO-TBC組在X線下見材料周圍低密度影界限較少，三維重建顯示pBMP2/TBC組缺損凹陷明顯，pBMP2/CGO-TBC組存在線狀或點狀凹陷，HE染色顯示pBMP2/TBC組在宿主骨邊緣附著少量新生骨，骨纖維排列混亂，pBMP2/CGO-TBC組可見宿主骨周圍大量新骨形成，材料中央有新骨和類

13、骨質形成；rhBMP2/TBC組和rhBMP2/CGO-TBC組材料與宿主骨之間界限模糊，材料大小減少明顯，CT三維重建顯示rhBMP2/TBC組存在線狀或點狀凹陷，rhBMP2/CGO-TBC組缺損處未見凹陷，HE染色顯示rhBMP2/TBC組內可見宿主骨邊緣和材料中央有新骨形成，骨纖維排列較為混亂；F組rhBMP2/CGO-TBC可見宿主骨邊緣和材料中央有大量新骨形成，并出現(xiàn)板層化。成骨面積百分比顯示，TBC組和CGO-TBC組成骨