羊水干細(xì)胞在皮膚損傷修復(fù)中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、皮膚指身體表面包在肌肉外面的組織，是人體最大的器官，主要承擔(dān)著保護(hù)身體、排汗、感覺冷熱和壓力等功能。皮膚覆蓋全身，它使體內(nèi)各種組織和器官免受物理性、機(jī)械性、化學(xué)性和病原微生物性的侵襲。當(dāng)由于外界損傷或疾病等因素造成皮膚缺損時，其危害可以是致命的。
　　皮膚組織工程是利用生物學(xué)和工程學(xué)原理，構(gòu)建出用于修復(fù)、維持和改善損傷組織功能的替代物，形成人工再生的皮膚等同物，移植于需要修復(fù)、重建的皮膚病損處。隨著干細(xì)胞和組織工程研究不斷深入,干

2、細(xì)胞作為種子細(xì)胞在組織工程中的價值得到逐步體現(xiàn)。尋找新型種子細(xì)胞在國內(nèi)外都是皮膚損傷修復(fù)研究領(lǐng)域的核心和熱點(diǎn)。
　　羊水細(xì)胞由于其所處的特殊的解剖位置，長期以來受到了人們的重視。對于羊水細(xì)胞的研究最早可追溯至20世紀(jì)初，隨著羊膜穿刺技術(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)條件的日趨成熟，羊水細(xì)胞的培養(yǎng)成功率也得到了提高，羊水細(xì)胞的研究也得到了迅速的發(fā)展。羊水細(xì)胞在基因突變導(dǎo)致的染色體異常、遺傳病和先天性代謝異常等疾病的產(chǎn)前診斷中發(fā)揮著重要作用。近年來研究發(fā)

3、現(xiàn)羊水細(xì)胞中含有多種干細(xì)胞的標(biāo)記物，且在體外通過特殊的誘導(dǎo)微環(huán)境能夠分化成多種不同類型的細(xì)胞，這使羊水來源干細(xì)胞成為干細(xì)胞研究的一個新的熱點(diǎn)。因此羊水作為干細(xì)胞的一個新的來源，將為干細(xì)胞的研究揭開一個新的研究領(lǐng)域，為組織工程提供新的種子細(xì)胞來源。
　　本研究皆在建立人羊水干細(xì)胞體外分離和培養(yǎng)方法，并分析其生物學(xué)特性，利用羊水干細(xì)胞的高增殖和多向分化潛能，開展羊水干細(xì)胞體外向表皮角質(zhì)細(xì)胞的分化研究，并在基因、蛋白、超微結(jié)構(gòu)等方面驗證

4、；在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步利用人羊水干細(xì)胞的低免疫原性的特征，構(gòu)建小鼠皮膚損傷模型，展開羊水干細(xì)胞對皮膚損傷修復(fù)的研究，觀察植入細(xì)胞的存活、遷移、分化及小鼠創(chuàng)面的修復(fù)，探討其加快小鼠創(chuàng)面修復(fù)的關(guān)鍵分子機(jī)制。同時，初步探討羊水干細(xì)胞在真皮層汗腺損傷修復(fù)中的作用，為皮膚組織工程提供理想的種子細(xì)胞，也為臨床治療大面積燒傷病人提出新方案，具有研究的創(chuàng)新性和潛在的應(yīng)用價值。
　　第一部分人羊水干細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法和生物學(xué)特征鑒定及其向表皮角質(zhì)細(xì)胞分

5、化的研究
　　目的：建立體外分離、提取、培養(yǎng)和純化人羊水干細(xì)胞的方法，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，在此基礎(chǔ)上，定向誘導(dǎo)羊水干細(xì)胞分化為表皮角質(zhì)細(xì)胞，并對其生物學(xué)特性及功能進(jìn)行鑒定。
　　方法：選取孕19-22周健康婦女羊膜穿刺之羊水組織，在無菌條件下用CD117磁珠分選，分選出陽性細(xì)胞，1200rpm離心后加入羊水干細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天全量換液。倒置顯微鏡觀察體外培養(yǎng)的羊水干細(xì)胞的形態(tài)，增殖情況

6、。RT-PCR檢測不同傳代次數(shù)羊水干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測其表面標(biāo)志物；細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)計數(shù)分析羊水干細(xì)胞的傳代增殖能力。待細(xì)胞生長至匯合率為70%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取第三代的羊水干細(xì)胞，以2×104個/皿的密度接種于6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，收集培養(yǎng)過人角質(zhì)細(xì)胞的KGM2培養(yǎng)基，用0.22μm的濾器過濾，收集到的培養(yǎng)基為條件培養(yǎng)基CM（Conditioned Medium）及添加誘導(dǎo)因子的角質(zhì)化細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)

7、培養(yǎng)基KBM2為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每天更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基；待誘導(dǎo)后的細(xì)胞生長至匯合率為70%-80%時，對細(xì)胞消化傳代，在倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)分化細(xì)胞的形態(tài)變化，待細(xì)胞出現(xiàn)上皮樣克隆時，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中額外添加 BMP4和維生素 C，待誘導(dǎo)分化30天后得到羊水干細(xì)胞來源的的角質(zhì)細(xì)胞。RT-PCR檢測、免疫熒光染色分別在基因、蛋白水平檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞的生物學(xué)特征；流式細(xì)胞術(shù)檢測羊水干細(xì)胞的分化率；透射電鏡技術(shù)觀察細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)；三維氣液組織培養(yǎng)方法及

8、H&E染色檢測分化后的羊水干細(xì)胞形成復(fù)層上皮的能力，免疫組織化學(xué)分析誘導(dǎo)分化的羊水干細(xì)胞形成復(fù)層上皮中各個不同層次的標(biāo)志蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：（1）羊水干細(xì)胞表達(dá)表皮干細(xì)胞標(biāo)志（K19和β1-integrin）、胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志（Oct4、Sox-2、c-Myc、Klf4、Rex-1和Nanog）和上皮細(xì)胞的標(biāo)志（K8和K18）及B7家族負(fù)性分子B7H1、B7H2、B7H3和B7H4及BTLA，但并不表達(dá)角質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志（K14）

9、和正性共刺激分子CD40、CD80和CD86；T淋巴細(xì)胞體外增殖實驗顯示，與羊水干細(xì)胞混合培養(yǎng)的 T淋巴細(xì)胞增殖較前明顯減緩，而加入B7H1和B7H4阻斷性抗體后，T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增加，且阻斷B7H4后的作用更為顯著；(2)羊水干細(xì)胞誘導(dǎo)分化獲得的角質(zhì)細(xì)胞呈典型的上皮樣形態(tài)，排列規(guī)則且緊密，邊界清晰，類似鋪路石狀，在基因和蛋白水平均表達(dá)正常角質(zhì)化細(xì)胞的標(biāo)志K5和K14，且分化率約為35%；(3)羊水干細(xì)胞分化而來的角質(zhì)細(xì)胞保留了羊水干

10、細(xì)胞的高核質(zhì)比，且具有羊水干細(xì)胞不具有的特殊細(xì)胞器：張力原纖維；（4）三維氣液培養(yǎng)及H&E染色結(jié)果顯示羊水干細(xì)胞來源的角質(zhì)細(xì)胞能夠進(jìn)一步分化成熟，形成復(fù)層上皮，表達(dá)角質(zhì)細(xì)胞成熟的標(biāo)志K10，Involucrin。
　　結(jié)論：從羊膜穿刺健康樣本，經(jīng)過CD117磁珠分選后，成功獲得羊水干細(xì)胞，其干性介于胚胎干細(xì)胞與成體干細(xì)胞之間，具有向表皮角質(zhì)細(xì)胞的分化潛能，表達(dá)B7家族負(fù)性分子，具有免疫調(diào)節(jié)作用及高增殖能力。體外誘導(dǎo)羊水干細(xì)胞獲得的

11、角質(zhì)細(xì)胞在基因和蛋白水平表達(dá)角質(zhì)化細(xì)胞標(biāo)志K5和K14，并具有角質(zhì)細(xì)胞典型的細(xì)胞器：張力原纖維，并且能進(jìn)一步分化成熟，形成復(fù)層上皮，表達(dá)角質(zhì)細(xì)胞成熟的標(biāo)志。因此，羊水干細(xì)胞可以做為皮膚損傷修復(fù)的有價值的種子細(xì)胞。
　　第二部分人羊水干細(xì)胞參與小鼠皮膚損傷修復(fù)的研究及初步機(jī)制探討
　　目的：建立小鼠背部皮膚損傷模型，利用羊水干細(xì)胞進(jìn)行移植修復(fù)，觀察移植后實驗動物皮膚損傷修復(fù)情況，羊水干細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的存活，細(xì)胞的增殖及分化并分

12、析其可能的修復(fù)機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究羊水干細(xì)胞在皮膚損傷修復(fù)中的作用奠定基礎(chǔ)，也為臨床治療提出新方案。
　　方法：利用穩(wěn)定傳代的羊水干細(xì)胞，用慢病毒轉(zhuǎn)染了GFP報告基因，病毒滴度為6.5×106 IU/ml，且流式檢測其轉(zhuǎn)化效率，確保后期實驗的準(zhǔn)確性。取鼠齡為4-6周的雄性 BALB/c小鼠，將其背部的毛發(fā)用電動理發(fā)器剔除后在構(gòu)建直徑為1cm的圓形皮膚缺損創(chuàng)面，在創(chuàng)面邊緣注射入轉(zhuǎn)染GFP的羊水干細(xì)胞，羊水干細(xì)胞的數(shù)量為5 x106

13、,將轉(zhuǎn)染GFP的相同數(shù)量的成纖維細(xì)胞及假手術(shù)組作為對照，并將手術(shù)后的小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，觀察至小鼠完全蘇醒并能自由活動，每隔一天觀察，并未出現(xiàn)異常及明顯的免疫排斥反應(yīng)。用UTHSCSA ImageTool軟件計算小鼠創(chuàng)面大小，并作圖分析；分別取小鼠創(chuàng)面4天的肉芽組織及14天的修復(fù)組織進(jìn)行H&E染色，觀察炎癥細(xì)胞、血管的新生及創(chuàng)面的修復(fù)情況；流式細(xì)胞術(shù)及免疫熒光染色技術(shù)檢測植入小鼠創(chuàng)面細(xì)胞的存活情況及分化情況；Real-Time PCR分別檢測

14、不同天數(shù)小鼠創(chuàng)面皮膚修復(fù)因子及炎癥相關(guān)因子的表達(dá)。利用小分子RNA干擾技術(shù)下調(diào)B7H4分子在羊水干細(xì)胞中的表達(dá)；制造皮膚損傷模型，在創(chuàng)面邊緣注射入下調(diào)B7H4的羊水干細(xì)胞，其數(shù)量為5 x106,將轉(zhuǎn)染GFP的成纖維細(xì)胞及正常羊水干細(xì)胞組作為對照，分別取不同組別的小鼠創(chuàng)面進(jìn)行免疫化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)檢測浸潤的T淋巴細(xì)胞數(shù)量；Real-Time PCR分別檢測不同天數(shù)不同組別小鼠創(chuàng)面皮膚修復(fù)因子及炎癥相關(guān)因子的表達(dá)，采用SPSS10.0統(tǒng)計學(xué)軟

15、件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X± s）表示，組間兩兩對比進(jìn)行t檢驗，以P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：(1)羊水干細(xì)胞組在移植細(xì)胞7天后，小鼠背部創(chuàng)面面積明顯小于成纖維細(xì)胞組和假手術(shù)組，術(shù)后14天，羊水干細(xì)胞組小鼠背部創(chuàng)面修復(fù)明顯加快，對照組創(chuàng)面愈合也較為明顯；術(shù)后21天，羊水干細(xì)胞組小鼠背部創(chuàng)面完全愈合，對照組創(chuàng)面較前縮小，但背部仍顯明顯創(chuàng)面；（2）羊水干細(xì)胞移植組新生表皮較成纖維細(xì)胞組和假手術(shù)組更厚，并且

16、有比較多的新生血管和成纖維細(xì)胞，未見浸潤的炎癥細(xì)胞，而成纖維細(xì)胞移植組和假手術(shù)組新生表皮較薄，有較多的炎癥細(xì)胞；術(shù)后14天，羊水干細(xì)胞移植組出現(xiàn)明顯的真皮乳頭結(jié)構(gòu)和毛囊等皮膚附屬器；（3）隨著修復(fù)的進(jìn)行，羊水干細(xì)胞在體內(nèi)的存在逐漸較少。熒光檢測結(jié)果顯示，羊水干細(xì)胞組和成纖維細(xì)胞組在術(shù)后7天仍有部分的GFP陽性細(xì)胞存在；術(shù)后21天，羊水干細(xì)胞組僅有個別GFP陽性細(xì)胞存在；(4)在修復(fù)早期，修復(fù)相關(guān)因子（bFGF，VEGF，CXCL12，T

17、GF-β1，KGF）在羊水干細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于成纖維細(xì)胞和假手術(shù)組，隨著修復(fù)的進(jìn)行，它們的表達(dá)逐漸下降，21天時，表達(dá)量與正常小鼠皮膚的表達(dá)接近，而成纖維細(xì)胞組和假手術(shù)組的修復(fù)因子在7天時表達(dá)明顯低于羊水干細(xì)胞組，21天才到達(dá)最高；而早期的炎癥相關(guān)因子（IL-1β，IL-6，TNF-α，Cox2及Mac3）在成纖維細(xì)胞組和假手術(shù)組的表達(dá)明顯高于羊水干細(xì)胞組，隨著修復(fù)的進(jìn)行，各組的表達(dá)都逐漸下降，到達(dá)21天，羊水干細(xì)胞中的表達(dá)接近于正常

18、小鼠皮膚的表達(dá)，而成纖維細(xì)胞組和假手術(shù)組在21天時仍然高于羊水干細(xì)胞組；(5)經(jīng)小分子RNA干擾后，羊水干細(xì)胞B7H4的表達(dá)明顯下降，與下調(diào)B7H4的羊水干細(xì)胞共培養(yǎng)的 T淋巴細(xì)胞增殖數(shù)量明顯增加，由此顯示羊水干細(xì)胞表達(dá)的共刺激分子B7H4是下調(diào)T細(xì)胞體內(nèi)外增殖的關(guān)鍵因子;（6）而免疫組化實驗結(jié)果也顯示，下調(diào) B7H4的羊水干細(xì)胞組有較多的浸潤 T淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測了浸潤 T淋巴細(xì)胞的比例發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞移植組、下調(diào) B7H4羊水

19、干細(xì)胞移植組浸潤的T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯高于羊水干細(xì)胞組；（7）相應(yīng)生物因子檢測結(jié)果表明，在修復(fù)早期，修復(fù)相關(guān)因子在羊水干細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于成纖維細(xì)胞和下調(diào)B7H4羊水干細(xì)胞移植組，隨著修復(fù)的進(jìn)行，它們的表達(dá)逐漸下降，而成纖維細(xì)胞組和下調(diào)B7H4羊水干細(xì)胞移植組因子的表達(dá)在21天時才到達(dá)最高；同時還發(fā)現(xiàn)，在早期，炎癥相關(guān)因子在成纖維細(xì)胞組和下調(diào)B7H4羊水干細(xì)胞組的表達(dá)明顯高于羊水干細(xì)胞組，隨著修復(fù)的進(jìn)行，各組的表達(dá)都逐漸下降，而成纖維細(xì)

20、胞組和下調(diào)B7H4羊水干細(xì)胞組的表達(dá)在21天時仍然高于羊水干細(xì)胞組。
　　結(jié)論：羊水干細(xì)胞能夠明顯加快小鼠創(chuàng)面的愈合，促進(jìn)血管形成，調(diào)節(jié)局部炎癥反應(yīng)，提前形成皮膚附屬器；在修復(fù)早期，羊水干細(xì)胞能夠在體內(nèi)直接誘導(dǎo)分化成為表皮角質(zhì)細(xì)胞，表達(dá)角質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志；隨著修復(fù)的完成，羊水干細(xì)胞在小鼠體內(nèi)逐漸消失。修復(fù)后期，羊水干細(xì)胞可通過微環(huán)境，募集小鼠自身的干細(xì)胞參與修復(fù)。其通過微環(huán)境加快小鼠背部創(chuàng)面的愈合可能是通過B7H4的介導(dǎo)作用。下調(diào) B7

21、H4在羊水干細(xì)胞的表達(dá)，可介導(dǎo)創(chuàng)面修復(fù)減緩，損傷微環(huán)境中 T淋巴細(xì)胞浸潤數(shù)量增加以及炎癥反應(yīng)加劇。我們的實驗發(fā)現(xiàn)負(fù)性B7家族分子-B7H4是介導(dǎo)羊水干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子。羊水干細(xì)胞通過表達(dá)負(fù)性分子B7H4,建立有利于創(chuàng)面修復(fù)的炎癥反應(yīng)微環(huán)境，從而加快創(chuàng)面的愈合。
　　第三部分人羊水干細(xì)胞向真皮汗腺細(xì)胞分化的研究
　　目的：定向誘導(dǎo)羊水干細(xì)胞分化為真皮汗腺樣細(xì)胞，并對其生物學(xué)特性及功能進(jìn)行鑒定，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討羊水干

22、細(xì)胞來源汗腺細(xì)胞對小鼠汗腺損傷修復(fù)。
　　方法：用傳統(tǒng)方法將羊水干細(xì)胞培養(yǎng)后,Real-time PCR檢測不同株羊水干細(xì)胞在汗腺相關(guān)基因的表達(dá)，分析其向汗腺細(xì)胞分化的潛能。取第三代的羊水干細(xì)胞，以2×104個/皿的密度接種于6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，收集培養(yǎng)過人汗腺細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，用0.22μm的濾器過濾，收集到的培養(yǎng)基為CM及添加shh的汗腺細(xì)胞培養(yǎng)基SGM為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，兩者比例為1：1，每天更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基；待誘導(dǎo)后的細(xì)胞生長至匯

23、合率為70%-80%時，對細(xì)胞消化傳代，在倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)分化細(xì)胞的形態(tài)變化，分別在7天，14天，21天，28天時對誘導(dǎo)的羊水干細(xì)胞進(jìn)行檢測。Real-time PCR、免疫熒光染色、分別在基因、蛋白水平檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞的生物學(xué)特征；流式細(xì)胞術(shù)檢測羊水干細(xì)胞的分化率；透射電鏡技術(shù)觀察細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)；三維氣液組織培養(yǎng)方法及H&E染色檢測分化后的羊水干細(xì)胞形成汗腺樣結(jié)構(gòu)的能力，免疫熒光染色分析誘導(dǎo)分化的羊水干細(xì)胞形成的汗腺樣結(jié)構(gòu)在汗腺相

24、關(guān)標(biāo)志的表達(dá)。在裸鼠肩部構(gòu)建汗腺損傷模型，將經(jīng)過生物學(xué)功能鑒定的羊水干細(xì)胞來源的汗腺細(xì)胞注射入損傷部位，注射入的細(xì)胞量為2X105。將PBS注射組，同體對側(cè)不做任何處理設(shè)為空白對照組。
　　結(jié)果：(1)羊水干細(xì)胞在汗腺相關(guān)基因K18,CD24及K19有比較高的表達(dá)，弱表達(dá)EDA，EDAR，K8,但不表達(dá)CEA；(2)羊水干細(xì)胞誘導(dǎo)分化獲得的汗腺細(xì)胞形成不同直徑的緊密排列的多層的扁平細(xì)胞，呈“鵝卵石”樣，在基因和蛋白水平均表達(dá)CEA

25、，且EDA,EDAR及K8的表達(dá)也有顯著提高，流式檢測其分化率約為30%以上；(3)透射電鏡結(jié)果顯示，羊水干細(xì)胞分化而來的汗腺細(xì)胞具有羊水干細(xì)胞不具有的特殊細(xì)胞器：微絨毛，乙酰膽堿實驗證明該汗腺的分泌功能；(4)三維氣液培養(yǎng)及H&E染色結(jié)果顯示羊水干細(xì)胞來源的汗腺細(xì)胞能夠進(jìn)一步分化成熟，形成汗腺樣結(jié)構(gòu)，表達(dá)汗腺腺體的標(biāo)志：EDA，EDAR，CEA，K8，K18，NA-K-ATP及SMA;(5)汗腺肩部損傷部位能夠形成汗腺腺體樣結(jié)構(gòu)，表達(dá)

26、K8,CEA等標(biāo)志。
　　結(jié)論：羊水干細(xì)胞具有向汗腺細(xì)胞的分化潛能。體外誘導(dǎo)羊水干細(xì)胞獲得的汗腺細(xì)胞在基因和蛋白水平表達(dá)汗腺細(xì)胞標(biāo)志 EDA,EDAR,K8,CEA，其分化率約為30%，分化獲得的汗腺細(xì)胞具有汗腺的典型特征：微絨毛，并且能進(jìn)一步分化形成汗腺樣結(jié)構(gòu)，表達(dá)汗腺腺體的標(biāo)志，能夠在體外修復(fù)損傷汗腺，形成汗腺腺體結(jié)構(gòu)。
　　綜上所述，本研究建立的羊水干細(xì)胞體外培養(yǎng)和擴(kuò)增體系，并檢測了其生物學(xué)特征，在此基礎(chǔ)上，體外分化形

27、成表皮角質(zhì)細(xì)胞不僅在細(xì)胞水平，更在分子、超微結(jié)構(gòu)上證實了分化而來的角質(zhì)細(xì)胞不僅具有正常角質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)，而且能進(jìn)一步成熟形成復(fù)層上皮,同時也通過體內(nèi)實驗證實羊水干細(xì)胞表達(dá)的負(fù)性B7H4分子介導(dǎo)其免疫調(diào)節(jié)作用，使小鼠皮膚創(chuàng)面修復(fù)效果顯著。并在此基礎(chǔ)上，初步研究了羊水干細(xì)胞向真皮層汗腺細(xì)胞的分化，證明了羊水干細(xì)胞不僅能在體外誘導(dǎo)分化形成汗腺細(xì)胞，并且能在體內(nèi)形成汗腺樣結(jié)構(gòu)，這為進(jìn)一步探討羊水干細(xì)胞移植治療大面積深度燒傷及其他免疫系統(tǒng)疾病的臨床