HNF4α在胎肝干細胞定向分化修復肝組織損傷中作用機理的研究.pdf

1、目的
　　肝組織損傷是各型肝臟疾病的共同病理基礎(chǔ)，嚴重的肝組織損傷將引起肝功能衰竭；干細胞治療修復肝組織損傷是目前國內(nèi)外醫(yī)學界研究的一個熱點,但由于存在體外富集純化困難、定向分化機制不明等問題而使其應用受到限制。胎肝細胞中富含的具有定向分化功能的干細胞是干細胞治療研究中的重要細胞來源。本研究擬探討建立體外擴增大鼠胚胎肝干細胞并抑制其分化的培養(yǎng)條件及方法，并在此基礎(chǔ)上，將胎肝干細胞通過門靜脈植入肝損傷大鼠體內(nèi)，觀察肝臟修復情況，檢測

2、治療前后HNF4α表達變化，探討HNF4α在胎肝干細胞促進肝組織損傷修復中的作用。本研究內(nèi)容共分為兩部分：1.體外瓊脂克隆培養(yǎng)對胎肝干細胞分化的影響；2.HNF4α在胎肝干細胞促肝組織損傷修復中的作用。探討這一重要調(diào)節(jié)過程中分子機理將為臨床應用胎肝干細胞移植治療肝臟疾病奠定重要的基礎(chǔ)。
　　方法
　　1.無菌條件下利用Ⅳ型膠原酶結(jié)合機械消化法制備14ｄ胎齡大鼠胎肝干細胞懸液。將原代分離得到的大鼠胎肝干細胞分成兩組，其中一組胚

3、胎肝干細胞接種至Ⅰ型膠原包被的培養(yǎng)板中，常規(guī)貼壁培養(yǎng)。另一組細胞則接種至無血清軟瓊脂培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)；懸浮培養(yǎng)基分為上下兩層，底層為含HGF的1.2％瓊脂，頂層為無血清的0.6％瓊脂，將胎肝干細胞接種至頂層培養(yǎng)基中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察兩組細胞的生長。培養(yǎng)2周后收集兩組細胞，電鏡觀察兩組細胞超微結(jié)構(gòu)的差異，流式細胞儀檢測其CD90.1+、CD49F+等干細胞標志物表達特征，堿性磷酸酶染色檢測其分化狀態(tài)的差異，實時定量PCR檢測兩組細

4、胞甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）的表達差異。
　　2.為研究HNF4α在胎肝干細胞促肝組織損傷修復中的作用，我們采用四氯化碳制作SD大鼠急性化學性肝損傷模型，造模成功后將肝損傷大鼠隨機分為移植組（20只）和對照組（20只），移植組將胎肝干細胞經(jīng)門靜脈移植至大鼠肝臟，對照組注射等容劑量的生理鹽水。分別于注射前6h，注射后1，3，5周檢測大鼠血清谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）的表達水平；取病理組織切片HE染色，

5、觀察肝組織修復情況；取肝組織切片采用免疫組化及提取部分肝組織蛋白用Westernblot方法檢測肝臟治療前后HNF4α表達情況。
　　結(jié)果
　　1.瓊脂克隆培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)部分胎肝干細胞未能有效增殖并形成克隆的細胞，這部分細胞不能在瓊脂培養(yǎng)基中存活，隨后發(fā)生凋亡崩解。剩余的細胞在2天后開始出現(xiàn)小的由3-5個細胞組成的細胞球，隨培養(yǎng)時間的延長，干細胞球不斷擴大，球內(nèi)細胞折光性好，連接緊密，未出現(xiàn)分化表現(xiàn)，從形態(tài)上判定為干細胞集落。原代

6、細胞接種后貼壁速度、分裂增生較慢，24h后相差顯微鏡下可見細胞貼壁生長，48h后觀察到分裂。1周后貼壁細胞體積逐漸增大鋪展呈上皮樣，形成集落。生長至90％左右時傳代后增長速度加快，表現(xiàn)出一些分化的特征。
　　2.電鏡下觀察，瓊脂克隆培養(yǎng)胎肝干細胞直徑約7μm～13μm，表面可見少量短小的微絨毛狀突起，整個細胞大部分被卵圓形胞核所占據(jù)，細胞質(zhì)少，核質(zhì)比例大，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、核糖體等細胞器不發(fā)達，表現(xiàn)為原始幼稚未分化細胞特征，即所謂的

7、肝干細胞。貼壁培養(yǎng)胎肝干細胞直徑明顯大于瓊脂克隆培養(yǎng)，約20～40μm，細胞核漿比例小，細胞質(zhì)內(nèi)可見大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、核糖體等發(fā)達細胞器，顯示出明顯的分化特征，與成熟肝細胞相似。通過流式分析發(fā)現(xiàn)，懸浮克隆培養(yǎng)的胎肝干細胞球高表達CD90.1、CD49F，明顯高于貼壁培養(yǎng)培養(yǎng)的胎肝干細胞。堿性磷酸酶染色，觀察細胞表面ALP的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)組染色為強陽性，貼壁培養(yǎng)為弱陽性。實時定量PCR檢測結(jié)果則表明，隨著培養(yǎng)時間的增加，貼壁培

8、養(yǎng)組的胎肝干細胞AFP表達明顯下降，ALB的表達呈明顯上升的趨勢（P<0.01）。而懸浮培養(yǎng)組的胎肝干細胞AFP和ALB的表達在培養(yǎng)前后未見明顯變化（P>0.05）。
　　3.四氯化碳誘導肝損傷模型后，各組SD大鼠根據(jù)肝病理組織顯示不同程度的損傷，經(jīng)胎肝干細胞移植處理后，對照組大鼠肝功能改善緩慢，ALT，AST明顯高于移植組，移植組大鼠損傷的肝組織逐漸修復，肝功能恢復正常。第5周移植組大鼠術(shù)后存活率顯著高于對照組。肝組織損傷后，H