MicroRNA介導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的研究.pdf

1、【背景】
　　肝再生醫(yī)學(xué)一直處在再生醫(yī)學(xué)的最前沿,原位肝移植和肝細(xì)胞移植均屬于肝再生醫(yī)學(xué)的范疇,原位肝移植被認(rèn)為是目前治療終末期肝病最行之有效的方法。但是由于供肝源缺乏、費用昂貴、免疫排斥等問題使原位肝移植不能成為最主要的治療方式。肝細(xì)胞移植可以有效改善終末期肝病患者的肝功,但肝細(xì)胞移植目前存在的問題主要有以下兩點:1.依靠供體器官獲得肝細(xì)胞,來源缺乏。2.凍存后的肝細(xì)胞會丟失部分肝細(xì)胞的功能,所以肝細(xì)胞在獲得后必須立即使用,這也

2、限制了其在臨床的應(yīng)用。因此,不依賴于器官捐獻獲得有功能的肝細(xì)胞樣細(xì)胞,就成了肝再生醫(yī)學(xué)亟待解決的問題,獲得有功能的iHEP有望解決供肝和肝細(xì)胞來源不足的問題,這對于肝再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展而言至關(guān)重要。目前,iHEP是通過誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞(EMC)、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS)、間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)和成纖維細(xì)胞而獲得。EMC誘導(dǎo)的iHEP細(xì)胞移植到動物體內(nèi)后有較高的致腫瘤性、致畸胎瘤性且由于受到倫理學(xué)的限制,因此目前僅用于藥理學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究。i

3、PS是由各種終末細(xì)胞去分化而獲得的EMC樣細(xì)胞,具有和干細(xì)胞類似的分化潛能,在理論上,由iPS獲得的iHEP細(xì)胞來源于患者自身,所以不存在免疫排斥和倫理學(xué)的問題,但由于 iPS的獲得需要轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)染,效率低下且改變了宿主基因,由iPS再分化為iHEP細(xì)胞,效率更低,且同樣存在致腫瘤性、致畸胎瘤性的風(fēng)險。由成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為iHEP細(xì)胞是近年來新的發(fā)現(xiàn),由成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為iHEP細(xì)胞的效率較低,且iHEP不具備成熟肝細(xì)胞的某些重要功

4、能。MSC可作為種子細(xì)胞的優(yōu)勢在于:其來源廣泛、非侵入性獲得、不存在倫理學(xué)問題,移植入動物體內(nèi)后具有低免疫原性、低致瘤性、低致畸胎瘤性。并且臍帶 MSC已經(jīng)成為再生醫(yī)學(xué)理想的細(xì)胞來源。由于目前的MSC來源的iHEP細(xì)胞還不夠成熟,且分化效率欠佳。為了獲得MSC來源的有功能的iHEP細(xì)胞,探索其分化機制就成了肝再生醫(yī)學(xué)亟待解決的問題。
　　MicroRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性非編碼小 RNA,通過抑制該配對區(qū)域mRNA的翻譯或促

5、進其降解從而在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控靶基因的表達。多項研究顯示 microRNA參與體內(nèi)多種生理過程的調(diào)控:廣泛參與體內(nèi)細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育、代謝、凋亡等多種生理活動。且近來多項研究顯示 microRNA參與各種細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化。
　　【目的】
　　本課題小組前期工作基礎(chǔ):⑴成功建立了MSC向肝細(xì)胞分化的體外模型;⑵根據(jù)microRNA基因芯片和PCR的一致性比對篩選出6個在MSC向肝細(xì)胞分化過程中線性升高的一組microRNA

6、(miR-30a、miR-1290、miR-1246、miR-542-5p、miR-424、miR-148a);⑶單獨使用該組microRNA和肝特異性miR-122誘導(dǎo)間充質(zhì)肝細(xì)胞,成功地將MSC誘導(dǎo)為有功能的誘導(dǎo)性肝細(xì)胞樣細(xì)胞(iHEP)。因此本實驗的目的是:在上述工作的基礎(chǔ)上進一步篩減誘導(dǎo)MSC向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化的關(guān)鍵microRNA。
　　【方法】
　　1.使用酶消化法分離臍帶 MSC:在無菌條件下采集健康孕婦所產(chǎn)足

7、月兒的臍帶,膠原酶消化法獲得純化的MSC,從大體形態(tài)、表面抗原鑒定、骨向分化能力等方面證實該方法分離的細(xì)胞是否為MSC,并檢測其純度和分化能力。
　　2.使用(n-1)的篩減策略:在7mix可誘導(dǎo)MSC為有功能的iHEP細(xì)胞的基礎(chǔ)上,依次使用篩減不同microRNA的6mix組合誘導(dǎo)MSC;若6mix組合可誘導(dǎo)MSC為有功能的iHEP細(xì)胞,則依照上述策略依次使用篩減不同microRNA的5mix組合誘導(dǎo)MSC,直到篩減到可將MSC

8、誘導(dǎo)為iHP細(xì)胞的最少microRNA組合。
　　3.iHEP細(xì)胞的驗證:倒置顯微鏡下觀察大體形態(tài)的變化;使用q-PCR對肝基因在mRNA水平變化進行檢測;western-blot對肝細(xì)胞特異蛋白進行檢測;肝細(xì)胞特異性功能檢測:PAS糖原染色、LDL攝取實驗、尿素氮合成能力、ICG心臟綠的攝取實驗的檢測用來驗證microRN誘導(dǎo)的iHEP細(xì)胞是否具有成熟肝細(xì)胞樣的功能。
　　【結(jié)果】
　　1.本課題小組使用酶消化法分離

9、的MSC在鏡下顯示典型的扁梭狀,4代以后呈現(xiàn)典型的渦旋狀生長方式。流式細(xì)胞儀分析表面抗原鑒定結(jié)果顯示:本實驗小組分離的臍帶來源的第四代(p4)MSC99.5％可表達MSC的標(biāo)志分子CD105。同時內(nèi)皮標(biāo)志分子CD31以及造血干細(xì)胞 CD34的檢測結(jié)果分別為:1.0%、1.0%,這一結(jié)果說明本實驗小組分離的MSC并沒有參雜內(nèi)皮細(xì)胞和血細(xì)胞,即證實了本課題小組分離的MSC純度較高。同時利用MSC向骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)液,來驗證分離所得MSC的分化

10、潛能。結(jié)果顯示:向p4的MSC內(nèi)加入骨細(xì)胞向誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液16天后,分化的細(xì)胞經(jīng)Alizarin紅染色后顯示(+),即具有骨細(xì)胞特有的鈣鹽沉積的作用。鈣鹽沉積的作用是骨細(xì)胞所特有的功能,證實了分離出的MSC具有分化潛能。
　　2.6mix組合誘導(dǎo)結(jié)果顯示:各組合的mimics轉(zhuǎn)染效率均較高,6mix-without-miR-30a(miR-122、miR-1290、miR-1246、miR-542-5p、miR-424、miR-1

11、48a)組合轉(zhuǎn)染 MSC后的iHEP細(xì)胞的特征:細(xì)胞具有肝細(xì)胞特有的上皮樣細(xì)胞形態(tài),q-PCR檢測肝細(xì)胞的特異性基因表達增高,較7mix(miR-122、miR-1290、miR-1246、miR-542-5p、miR-424、miR-148a、miR-30a)誘導(dǎo)的iHEP細(xì)胞,肝細(xì)胞特有的ALB的表達略有降低,肝細(xì)胞特異性功能檢測:PAS染色、尿素氮合成檢測、ICG攝取實驗、LDL攝取實驗結(jié)果均為陽性。6mix-without-mi

12、R-1290誘導(dǎo)組的肝基因表達亦較高但低于6mix-without-miR-30a誘導(dǎo)組。而其他6mix誘導(dǎo)組的肝基因表達變化與陰性對照相比無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3.5mix組合誘導(dǎo)結(jié)果顯示:各組合的mimics的轉(zhuǎn)染效率均較高,5mix-without-miR-1290(miR-122、miR-1246、miR-542-5p、miR-424、miR-148a)組合轉(zhuǎn)染MSC后細(xì)胞具有肝細(xì)胞的上皮樣形態(tài),肝細(xì)胞的特異性基因表達增高,

13、較6mix(miR-122、miR-1290、miR-1246、miR-542-5p、miR-424、miR-148a)誘導(dǎo)組和7mix誘導(dǎo)組,早期肝基因變化無明顯差異,而中晚期肝基因TF、CYP3A4、G6P表達降低。肝細(xì)胞特異性功能檢測:PAS染色結(jié)果、尿素氮檢測、ICG攝取實驗結(jié)果、LDL攝取實驗結(jié)果均為陽性。而其他5mix誘導(dǎo)組的肝基因表達變化與陰性對照相比無統(tǒng)計差異。
　　4.4mix組合誘導(dǎo)結(jié)果顯示:4mix-with

14、out-miR-542-5p中AFP的升高具有統(tǒng)計學(xué)意義;其他4mix組合肝基因ALB、HNF4A變化較陰性對照無明顯差異。
　　【結(jié)論】
　　使用酶消化法獲得的臍帶來源的MSC,具有 MSC典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài),表達MSC的標(biāo)志分子,且可分化為骨細(xì)胞樣細(xì)胞。miR-122、miR-1246、miR-542-5p、miR-424、miR-148a轉(zhuǎn)染MSC后細(xì)胞可誘導(dǎo)為有功能的iHEP細(xì)胞:具有肝細(xì)胞的上皮樣形態(tài),肝細(xì)胞的