槐糖脂補料發(fā)酵及抗真菌、抗腫瘤活性的研究.pdf

1、生物表面活性劑是微生物在一定條件下培養(yǎng)時，在其代謝過程中分泌出的具有一定表面活性的代謝產(chǎn)物。與化學(xué)合成的表面活性劑相比，生物表面活性劑除具有降低表面張力、穩(wěn)定乳化液和增加泡沫等相同作用外，還具有一般化學(xué)合成的表面活性劑所不具備的無毒、生物可降解性、無污染、良好的選擇性、專一性和生物相容性等優(yōu)點。隨著人類社會的進(jìn)步與發(fā)展和人們環(huán)保意識的增強，生物表面活性劑部分取代化學(xué)合成表面活性劑，在人類生產(chǎn)、生活中發(fā)揮重要作用將成為必然趨勢。
　

2、　 槐糖脂是一種由酵母產(chǎn)生的糖酯類生物表面活性劑，由于其生物可降解性，低毒性，良好的環(huán)境兼容性，以及產(chǎn)量高等很多優(yōu)點，在石油工業(yè)、環(huán)境保護(hù)、化妝品、洗滌劑及藥學(xué)領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。近年來，槐糖脂在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用尤其得到了研究者的關(guān)注，很多報道證明了槐糖脂具有很好的抗微生物、抗腫瘤甚至抗艾滋病毒的活性。
　　 本文的主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 1.補料發(fā)酵提高槐糖脂的產(chǎn)量：
　　 在本實驗室前期篩選到一株

3、高產(chǎn)槐糖脂擬威克酵母菌株，并開展了部分發(fā)酵條件優(yōu)化研究的基礎(chǔ)上，本文通過補料發(fā)酵的方法，在發(fā)酵過程中向培養(yǎng)基中補加菜籽油提高了槐糖脂的產(chǎn)量。300 mL搖瓶補料發(fā)酵，在發(fā)酵過程中補加三次5％菜籽油后，槐糖脂產(chǎn)量為43.1 g/L，比分批發(fā)酵的槐糖脂產(chǎn)量提高了32％。在5 L發(fā)酵罐中擴大生產(chǎn)槐糖脂，補料發(fā)酵288 h后，槐糖脂產(chǎn)量為68.2 g/L，比搖瓶分批發(fā)酵提高了109.2％，比搖瓶補料發(fā)酵產(chǎn)量提高了58.2％。將5 L發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速

4、從400 rpm提高到500 rpm，發(fā)酵196 h后，槐糖脂產(chǎn)量達(dá)到71.1 g/L，與提高轉(zhuǎn)速之前相比，槐糖脂的產(chǎn)量略高一點，但是發(fā)酵周期大大縮短，由288 h縮短到196 h，提前了96 h，槐糖脂的容積生產(chǎn)率由0.24 g/L/h提高到0.37 g/L/h。
　　 2.槐糖脂對細(xì)菌抑制作用的研究：
　　 研究了槐糖脂對幾種常見細(xì)菌大腸桿菌(Escherichia.coil)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus.cer

5、eus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus.aureus)以及能引起齲齒的變形鏈球菌(Streptococcus mutans)的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)槐糖脂對革蘭氏陽性菌有明顯的抑制作用，當(dāng)槐糖脂濃度達(dá)到15 mg/L時就能夠完全抑制蠟狀芽孢桿菌的生長。與對金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度40 mg/L相比，槐糖脂對蠟狀芽孢桿菌的最低抑制濃度更小?；碧侵瑢Υ竽c桿菌幾乎沒有抑制作用。首次報道了槐糖脂對引起齲齒的變形鏈球菌具有明顯的抑

6、制作用。當(dāng)槐糖脂濃度達(dá)到50mg/L時就能夠完全抑制變形鏈球菌的生長，將其添加到牙膏或漱口水中可以有效的防治齲齒的發(fā)生。
　　 3.槐糖脂對皮膚癬菌抑制作用的研究：
　　 研究了槐糖脂對紅色毛癬菌、石膏樣毛癬菌和犬小孢子菌這三種常見的皮膚病致病菌的抑制作用，結(jié)果證明槐糖脂對這三種皮膚癬菌都具有抑制作用。培養(yǎng)5天時，內(nèi)酯型槐糖脂完全抑制紅色毛癬菌、石膏樣毛癬菌和犬小孢子菌的濃度分別為0.5 g/L、0.1 g/L和0.1

7、g/L；酸型槐糖脂完全抑制紅色毛癬菌、石膏樣毛癬菌和犬小孢子菌的濃度分別為0.5 g/L、0.25 g/L和0.5 g/L。比較了培養(yǎng)7天后內(nèi)酯型槐糖脂和酸型槐糖脂對這三種皮膚癬菌的作用效果的不同，發(fā)現(xiàn)對紅色毛癬菌來說，內(nèi)酯型槐糖脂的抑制效果比酸型槐糖脂的抑制效果好一點；對石膏樣毛癬菌來說，在低濃度的條件下，內(nèi)酯型槐糖脂的抑制作用要好于酸型槐糖脂，在高濃度的條件下，酸型槐糖脂的抑制作用要好于內(nèi)酯型槐糖脂；對犬小孢子菌來說，內(nèi)酯型槐糖脂的

8、抑制效果比酸型槐糖脂的抑制效果好很多。
　　 內(nèi)酯型槐糖脂比酸型槐糖脂能更好的抑制三種皮膚癬菌的菌絲延伸。當(dāng)內(nèi)酯型槐糖脂濃度為0.5 g/L時，紅色毛癬菌、石膏樣毛癬菌和犬小孢子菌的菌絲延伸抑制率分別為53.8％，62.5％和68.2％。內(nèi)酯型槐糖脂對紅色毛癬菌、石膏樣毛癬菌和犬小孢子菌的MIC50值分別是0.0625，0.125，0.0625 mg/mL，MIC90值分別是0.125，0.25，0.125 mg/mL，MFC值

9、分別是0.5，0.5，0.25 mg/mL。
　　 通過透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過內(nèi)酯型槐糖脂處理后，紅色毛癬菌、石膏樣毛癬菌和犬小孢子菌的細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)都發(fā)生了明顯改變。細(xì)胞壁變厚而且松散，細(xì)胞質(zhì)凝集，細(xì)胞器的膜消失，細(xì)胞質(zhì)中沒有完整的細(xì)胞器和核區(qū)。
　　 4.對槐糖脂粗品進(jìn)行分離純化，并鑒定槐糖脂純品的結(jié)構(gòu)：
　　 將擬威克酵母利用菜籽油為第二碳源發(fā)酵得到的槐糖脂粗品經(jīng)HPLC分析，發(fā)現(xiàn)槐糖脂粗品中含有多達(dá)十幾種

10、以上的組分。其中含量較高的10種組分用制備型HPLC進(jìn)行了制備，并用質(zhì)譜分析這10種槐糖脂組分的結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)我們分離得到的槐糖脂組分的脂肪酸部分都是18碳脂肪酸，而它們的結(jié)構(gòu)的區(qū)別在于脂肪酸部分的不飽和程度不同(無雙鍵、一個雙鍵或兩個雙鍵)，槐糖脂部分的乙酰化程度不同(單乙?；?、雙乙酰基、非乙?；?，以及是否存在內(nèi)酯化(內(nèi)酯型、酸型)。
　　 5.不同結(jié)構(gòu)的槐糖脂組分對食管癌細(xì)胞抑制作用的研究
　　 研究了不同結(jié)構(gòu)的天

11、然槐糖脂組分對食管癌細(xì)胞KYSE109和KYSE450的抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)槐糖脂分子的乙酰化程度、脂肪酸部分飽和程度和是否內(nèi)酯化都對其抗腫瘤活性有重要的影響。
　　 (1)內(nèi)酯型槐糖脂的抗腫瘤作用與槐糖部分的乙?；臄?shù)量有關(guān)，雙乙?；鶅?nèi)酯型槐糖脂對食管癌細(xì)胞的抑制效果(30μg/mL的濃度就可以完全殺滅細(xì)胞)好于單乙?；鶅?nèi)酯型槐糖脂(60μg/mL的濃度能夠完全殺死細(xì)胞)。
　　 (2)首次報道了內(nèi)酯型槐糖脂的抗腫瘤作用與

12、脂肪酸部分的不飽和程度有關(guān)。脂肪酸部分含有1個雙鍵的內(nèi)酯型槐糖脂分子對食管癌細(xì)胞具有最強的細(xì)胞毒性(30μg/mL的濃度就可以完全殺死細(xì)胞)，脂肪酸部分含有2個雙鍵的內(nèi)酯型槐糖脂分子對食管癌細(xì)胞的抑制作用稍弱(60μg/mL的濃度能夠完全殺死細(xì)胞)，脂肪酸部分沒有雙鍵的內(nèi)酯型槐糖脂分子對食管癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性最弱(60μg/mL的濃度只能夠抑制20％的細(xì)胞生長)。
　　 (3)酸型槐糖脂無論槐糖部分是雙乙酰基還是單乙?；舅岵?/p>

13、分是一個雙鍵還是兩個雙鍵，其對食管癌細(xì)胞都基本沒有抑制作用。
　　 6.不同結(jié)構(gòu)槐糖脂對于食管癌細(xì)胞KYSE450抗腫瘤作用機制的研究
　　 實驗室之前的研究證明，脂肪酸部分為C18:1的雙乙酰內(nèi)酯型槐糖脂抑制人肝癌細(xì)胞H7402的機制是引起細(xì)胞的凋亡。本文選取了C18:1 MLSL和C18:1DLSL兩種槐糖脂，以食管癌細(xì)胞KYSE450作為研究對象，采用多種檢測方法，細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(如光學(xué)顯微鏡觀察、電子顯微鏡觀察、

14、熒光顯微鏡觀察)，流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期分布及凋亡率以及DNA裂解的原位檢測對不同結(jié)構(gòu)槐糖脂對于食管癌細(xì)胞KYSE450的抗腫瘤作用和機制進(jìn)行了研究。
　　 通過形態(tài)學(xué)觀察，槐糖脂作用后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了變化，細(xì)胞收縮、變圓、體積變小、膜泡突出并且出現(xiàn)一些小體結(jié)構(gòu)，有些細(xì)胞從培養(yǎng)板壁脫離下來。細(xì)胞核染色質(zhì)凝集，凝聚于核膜內(nèi)側(cè)，發(fā)生邊緣化，有的細(xì)胞核碎裂成多個塊狀，DNA片斷化，并出現(xiàn)膜包繞的凋亡小體。通過流式細(xì)胞儀分析說明細(xì)胞周

15、期的分布發(fā)生了變化，并且出現(xiàn)了非常明顯的亞二倍體峰。以上都表明，這兩種結(jié)構(gòu)的槐糖脂都能夠在一定濃度范圍內(nèi)引起食管癌細(xì)胞的凋亡，說明槐糖脂抑制腫瘤細(xì)胞的機制對于不同的腫瘤細(xì)胞具有一致性，都是引起細(xì)胞凋亡。
　　 另外，不同結(jié)構(gòu)的槐糖脂在相同濃度下引起腫瘤細(xì)胞凋亡的水平也不相同，無論從細(xì)胞形態(tài)觀察還是從細(xì)胞周期的變化以及凋亡率的大小，都可以說明，相同濃度的C18:1 DLSL比C18:1 MLSL能誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞KYSE450更大程