萜類小分子及金屬銅的抗真菌活性研究.pdf

1、近年來，以念珠菌為主的深部真菌感染的發(fā)病率和病死率逐年上升。真菌耐藥性的出現(xiàn)和迅速蔓延，降低了傳統(tǒng)抗真菌藥物的治療效果，使得臨床真菌感染治療面臨嚴峻的挑戰(zhàn)。因此開發(fā)新型抗真菌藥物，并積極尋找新的克服真菌感染和耐藥的有效策略，是當今抗真菌感染研究的重要任務。
　　苔蘚植物廣泛分布于自然界，生命力頑強，作為傳統(tǒng)的藥用資源，近年來已從中篩選出很多具有較好抗真菌活性的化合物。萜類是苔蘚植物中被發(fā)現(xiàn)種類最多的化學成分，生物活性廣泛，具有重要

2、的應用價值。我們采用最低抑菌濃度篩選模型，對本課題組所建化合物庫中的106個萜類小分子進行了初步篩選，從中發(fā)現(xiàn)了5個具有較好抗真菌活性的小分子化合物，包括3個倍半萜類和2個二萜類小分子，對白色念珠菌的最低抑菌濃度均小于128 ug/ml。其中，從多苞裂萼苔Chiloscyphus polyanthus和白葉鞭苔Bazzania albifolia中均分離得到一種重排草蒲烯烷型倍半萜chiloscyphenol A(CA)，該小分子抗真菌

3、活性強、儲存量多，用于開展更深入的抗真菌活性研究。
　　經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，CA對五種念珠菌均表現(xiàn)出殺菌活性，最低抑菌濃度為8～32ug/ml，并且能有效抑制被膜的形成，對成熟被膜也具有一定的清除作用。實驗結(jié)果顯示，在CA作用下，白色念珠菌的線粒體膜電勢和ATP含量發(fā)生顯著改變，線粒體外膜蛋白Tom70呈異常分布，并伴有ROS的生成，過度累積的ROS進一步對線粒體和其他細胞結(jié)構(gòu)造成氧化損傷。此外，采用熒光染色，透射電子顯微鏡(TEM)觀察

4、，以及鈣黃綠素釋放實驗等多種方法檢測發(fā)現(xiàn)，CA處理后的白色念珠菌細胞膜受到嚴重損傷，通透性增加。細胞形態(tài)皺縮的現(xiàn)象則進一步確證了CA對細胞膜的破壞作用。因此我們推斷，CA通過損傷線粒體和破壞細胞膜發(fā)揮抗真菌作用。
　　銅表面具有廣泛的抑制或殺滅病原體的作用，將銅及銅合金應用到臨床，是真菌感染防治的一個新思路。已有研究顯示，銅及銅合金能在90 min內(nèi)殺滅全部的浮游態(tài)白色念珠菌。本研究通過測定時間-殺菌曲線，發(fā)現(xiàn)金屬銅對白色念珠菌成

5、熟被膜也具有很好的殺菌效果。離子釋放實驗顯示，銅片釋放的銅離子濃度遠遠低于硫酸銅的有效作用濃度，說明銅自身釋放的銅離子并非銅表面接觸殺菌的決定性因素。通過熒光染色觀察發(fā)現(xiàn)，在銅片的作用下，白色念珠菌被膜細胞內(nèi)ROS迅速累積，并在一定時間內(nèi)呈時間依賴性。此外，我們還發(fā)現(xiàn)被膜形成相關基因ALS1、ALS3的突變株所形成的被膜更加耐受銅片的清除作用。采用FDA/PI染色觀察，未發(fā)現(xiàn)被膜內(nèi)的細胞形態(tài)與細胞死活狀態(tài)相關。另外，電感耦合等離子體發(fā)射

6、光譜儀(ICP-AES)分析結(jié)果顯示，ALS突變株胞內(nèi)銅離子濃度顯著低于野生株。CRP1和CUP1是白色念珠菌細胞內(nèi)與銅穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)相關基因，檢測發(fā)現(xiàn)，銅作用后，ALS突變株的CUP1表達量無明顯變化，而CRP1的表達量顯著增加。綜上所述，我們推測，銅表面與白色念珠菌被膜接觸后，能在接觸部位產(chǎn)生高濃度銅離子而損壞細胞膜，大量銅離子緊接著涌入細胞內(nèi)，誘導ROS的累積，引起氧化損傷從而導致細胞死亡，而Als1和Als3蛋白能通過抑制銅離子外排泵

7、CRP1的表達促進該過程。
　　本論文通過篩選，得到了5個具有抗真菌活性的萜類小分子，并以CA作為代表，闡述了倍半萜類天然產(chǎn)物的抗真菌活性及其作用機制，為開發(fā)倍半萜作為新型抗真菌藥物提供了理論依據(jù)，也為今后研究其他倍半萜類化合物的抗真菌機制提供了一個很好的思路。此外，我們還確證了金屬銅的抗真菌作用，第一次深入研究了金屬銅對白色念珠菌生物被膜的清除效果，并發(fā)現(xiàn)了兩個與被膜耐受銅相關的基因ALS1和ALS3，為推進銅材料在臨床上的應用