槐糖脂產(chǎn)生菌的篩選及槐糖脂抑菌和抗腫瘤作用的研究.pdf

1、表面活性劑在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類日常生活中的應(yīng)用越來越廣泛，但是通過化學(xué)法合成的表面活性劑在合成和使用的過程中會對環(huán)境造成污染和破壞。而生物表面活性劑是微生物在一定條件下代謝產(chǎn)生的或者通過酶法合成的，與化學(xué)法合成的表面活性劑相比有相同特性又有很多優(yōu)點，特別是無毒、微生物可降解這一優(yōu)點是化學(xué)法合成的表面活性劑所不可比擬的，因此在石油、環(huán)境、食品、農(nóng)業(yè)及醫(yī)藥等方面具有極其重要的應(yīng)用價值。 微生物產(chǎn)生的生物表面活性劑種類很多，槐糖脂由于結(jié)

2、構(gòu)特殊、無毒、生物可降解，容易獲得并且產(chǎn)量較高，是目前研究較多、也是最具有應(yīng)用前途的一種。對于槐糖脂的研究，目前主要集中在兩個方面：一是提高槐糖脂的產(chǎn)量；二是槐糖脂的應(yīng)用，集中在石油、環(huán)境保護、洗滌劑、化妝品等方面。槐糖脂在醫(yī)藥方面的應(yīng)用研究不多，特別是槐糖脂的抗腫瘤作用機理研究國內(nèi)外尚無報道。因此，有必要篩選新型的槐糖脂產(chǎn)生菌，并對槐糖脂的藥效作用及其作用機理進行探討，這將為抗癌新藥的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)提供可能和指導(dǎo)。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：

3、 1．新型槐糖脂產(chǎn)生菌的篩選。以菜籽油為唯一底物，通過富集培養(yǎng)、平板劃線等方法篩選到200多株菌；利用油膜破裂法和測定發(fā)酵液的表面張力得到5株產(chǎn)表面活性劑的菌株；最后通過色譜技術(shù)，包括TLC(thin layerchromatography)、IR(infrared)spectra、HPLC、NMR(nuclear magnetic resonance)及MS(mass spectroscopy)，進一步確定了產(chǎn)槐糖脂的菌株為Y

4、<，2A>。該菌株能將發(fā)酵液的表面張力降為37.3 mN/m，產(chǎn)生的產(chǎn)物是糖脂的混合物，含量較高的主要有三種成分，其保留時間分別為33.28，34.62和38.15min，命名為化合物Ⅰ、化合物Ⅱ、化合物Ⅲ，化合物Ⅲ是內(nèi)酯型雙乙?；碧侵?。 通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實驗及BIOLOG菌種鑒定系統(tǒng)對’Y<,2A>菌株進行種屬鑒定，確定Y<,2A>菌株為擬威克酵母(Wickerhamiella domercqiae Y<,2A>)。這

5、是國內(nèi)外首次報道擬威克酵母能夠產(chǎn)生槐糖脂。 2．培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵條件影響著擬威克酵母產(chǎn)生槐糖脂的產(chǎn)量。采用單因子及正交試驗首先對擬威克酵母產(chǎn)槐糖脂的碳源和氮源進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)單獨以葡萄糖或菜籽油為碳源槐糖脂產(chǎn)量很低，說明葡萄糖對于菌體的生長是必需的，同時菜籽油對槐糖脂的產(chǎn)生具有誘導(dǎo)作用，因此最佳碳源為葡萄糖和菜籽油的混合物，8％(w/v)的葡萄糖和8％(v/v)的菜籽油。隨后又對氮源進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)有機氮源比無機氮源更有利于槐

6、糖脂的產(chǎn)生，以酵母粉最好，并且低濃度的酵母粉利于槐糖脂的產(chǎn)生，以0.3％的酵母粉為氮源槐糖脂產(chǎn)量最高。最后對初始pH和接種量進行了優(yōu)化，優(yōu)化的最優(yōu)pH為6.0；最佳接種量為2.5％。在以上條件下，最佳發(fā)酵時間148 h，槐糖脂產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了10倍以上，達到41.3 g/L。 3．槐糖脂在石油開采、環(huán)境修復(fù)等方面的應(yīng)用越來越受到人們的重視。在提高石油采收率的三次采油技術(shù)中，微生物提高石油采收率技術(shù)是采用較晚但前景頗為看好的技

7、術(shù)，此技術(shù)的原理之一就是利用微生物產(chǎn)生的表面活性劑對石油的乳化作用，降低了石油的粘度從而提高其開采率。通過對擬威克酵母發(fā)酵液的理化特性進行初步研究，發(fā)現(xiàn)該菌株發(fā)酵液的表面活性在一定的礦化度(小于12％)、pH(2～6)及高溫(小于120℃)下不受影響，并且對原油具有較好的乳化性能，具有繼續(xù)開發(fā)利用的前景。 4．槐糖脂的藥效學(xué)研究是槐糖脂研究的一個新領(lǐng)域，也是槐糖脂研究的一個重要發(fā)展方向。 (1)實驗證明內(nèi)酯型雙乙?；碧?/p>

8、脂(化合物Ⅲ)具有抑菌活性，當(dāng)濃度≥2.5mg/mL時，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、粗糙脈胞菌的生長完全受到抑制，而對其他試驗菌株則沒有作用。 (2)利用MTT法，以腫瘤細(xì)胞的存活率為指標(biāo)對內(nèi)酯型雙乙?；碧侵目鼓[瘤活性進行了研究。結(jié)果表明，內(nèi)酯型雙乙?；碧侵€具有抗腫瘤作用，在一定濃度范圍內(nèi)，H7402(人肝癌細(xì)胞)、A549(人肺腺癌細(xì)胞)、HL60(人急性早幼粒白血病細(xì)胞)和K562(人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞)，

9、四種腫瘤細(xì)胞的存活率與濃度呈依賴關(guān)系，當(dāng)濃度≥62.5μg/ml時，細(xì)胞全部死亡。 5．選取人肝癌細(xì)胞系H7402，運用多種方法和技術(shù)首次對內(nèi)酯型雙乙酰槐糖脂誘導(dǎo)H7402腫瘤細(xì)胞的凋亡進行了系統(tǒng)研究。首先用倒置顯微鏡、細(xì)胞染色技術(shù)、激光掃描共聚焦顯微鏡和電子顯微鏡對細(xì)胞的形態(tài)變化進行了觀察；然后利用流式細(xì)胞技術(shù)確定了內(nèi)酯型雙乙?；碧侵T導(dǎo)后細(xì)胞周期分布的變化；最后對腫瘤細(xì)胞進行了TUNEL(TdT-mediated dUTP