2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、表面活性劑是一類最重要的精細化工產(chǎn)品,廣泛應用于家庭、工業(yè)和農(nóng)業(yè)。人們生活工作的各個方面幾乎都離不開表面活性劑。隨著人類社會的進步與發(fā)展以及人們環(huán)保意識的增強,生物表面活性劑替代化學合成的表面活性劑將成為必然趨勢?;碧侵且活愑山湍府a(chǎn)生的糖脂類生物表面活性劑,由于其具有高產(chǎn)量、生物可降解性、低毒性和良好的環(huán)境兼容性等許多優(yōu)點,可廣泛應用于石油、環(huán)境保護、化妝品、洗滌劑、藥學及納米科技等工業(yè)領域,尤其是在醫(yī)藥領域的應用得到了研究者的廣泛關

2、注。因此,槐糖脂被認為是一種最有發(fā)展和應用潛力的、可能替代化學表面活性劑的可再生的生物表面活性劑,對其開發(fā)及應用將會帶來極大的經(jīng)濟效益和生態(tài)效益。
   本論文的主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
   1.低能離子束注入誘變選育高產(chǎn)槐糖脂菌株
   目前,對產(chǎn)槐糖脂菌株的誘變育種研究較少。本論文對實驗室現(xiàn)有的產(chǎn)槐糖脂菌株W.domercqiae Y2A采用低能N+注入的方式進行了誘變育種。
   選取N+作為離子

3、束注入的離子源,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過不同劑量N+注入后,菌株Y2A的存活率曲線是典型的“馬鞍型”曲線,即隨著注入劑量增加,存活率呈現(xiàn)出先降低后升高再降低的趨勢。選取的誘變劑量是3×1015 ions/cm2,經(jīng)過注入誘變選育后,18個突變株菌的總槐糖脂產(chǎn)量較出發(fā)株提高了20%以上,18個突變株的內(nèi)酯型槐糖脂產(chǎn)量較出發(fā)株提高了100%以上;5個突變株的酸型槐糖脂產(chǎn)量較出發(fā)株提高了30%以上。其中,菌株N3-18在搖瓶水平發(fā)酵時總槐糖脂產(chǎn)量可達104

4、g/L,較出發(fā)株提高了約84.71%,酸型槐糖脂產(chǎn)量達77 g/L,較出發(fā)株提高了1.48倍;在5-L發(fā)酵罐水平,其總槐糖脂產(chǎn)量可達135 g/L,較出發(fā)株產(chǎn)量提高一倍左右。
   出發(fā)株和5株高產(chǎn)菌株所產(chǎn)的總槐糖脂組成的HPLC分析表明,各突變株所產(chǎn)槐糖脂組成同出發(fā)株相同,但是,突變株的多數(shù)槐糖脂分子的峰面積較原菌株有較大提高,某些槐糖脂組分在總槐糖脂中所占的比例同野生株有較大變化,得到了內(nèi)酯型或者酸型槐糖脂比例增加的突變株,

5、而這些特定的高產(chǎn)菌株可以更好的應用于不同的工業(yè)領域。
   2.新型槐糖脂的生產(chǎn)、分離純化及結(jié)構鑒定
   槐糖脂的結(jié)構會影響其理化活性和生物學活性。天然合成的槐糖脂脂肪酸部分通常是16C或18C,本工作旨在獲得脂肪酸部分碳鏈>18 C或者為C18∶3的新型槐糖脂。
   分別以菜籽油、亞麻油和魚油為疏水性碳源發(fā)酵槐糖脂,得到了三種組分差異較大的槐糖脂混合物。利用制備型HPLC制備得到了這三種槐糖脂粗品中的主要組

6、分,并用MS、MS/MS和GC-MS分析了這幾種槐糖脂純品的結(jié)構。以亞麻油為底物時,首次在W.domercqiae中得到了脂肪酸部分為C18∶3的雙乙?;瘍?nèi)酯型槐糖脂,并且,該物質(zhì)的抗腫瘤活性未有報道。以富含長鏈脂肪酸的魚油為底物時得到了碳鏈長度大于18C的新型槐糖脂,包括:脂肪酸部分為C20∶5的,不含、含有一個或兩個乙?;乃嵝突碧侵?脂肪酸部分為C22∶6的雙乙?;嵝突碧侵?脂肪酸部分為C22∶3的無乙?;膬?nèi)酯型槐糖脂;脂肪酸

7、部分為C20∶0的無乙?;膬?nèi)酯型槐糖脂。這些新型槐糖脂可能會拓寬槐糖脂的應用領域。
   3.槐糖脂脂肪酸部分結(jié)構對其抗官頸癌活性影響、體外誘導細胞凋亡的途徑和體內(nèi)抗宮頸癌活性的研究
   雖然之前的研究已經(jīng)證明了槐糖脂純品的乙?;潭取⒅舅岵糠值牟伙柡投燃笆欠翊嬖诜肿觾?nèi)內(nèi)酯化等都會影響其抗腫瘤活性,脂肪酸的碳鏈長度和多不飽和度(雙鍵>2)對槐糖脂抗腫瘤活性的影響還沒有被系統(tǒng)研究過。另外,槐糖脂引起細胞凋亡的信號通路

8、也不清楚。目前,槐糖脂的抗腫瘤活性多限于體外實驗,體內(nèi)抗腫瘤活性報道非常少。
   選取6種雙乙?;瘍?nèi)酯型槐糖脂分子,其脂肪酸部分分別為C18∶0,C18∶1,C18∶2,C18∶3,C16∶0和C16∶1,對這些槐糖脂分子對HeLa和CaSki細胞的細胞毒性進行了研究。結(jié)果表明,槐糖脂的細胞毒性大小不僅受脂肪酸不飽和度影響,同時也受脂肪酸鏈長影響。研究脂肪酸鏈長對槐糖脂體外抗宮頸癌活性的影響發(fā)現(xiàn):碳鏈長度越長,槐糖脂的細胞毒性

9、越大。不同槐糖脂分子的細胞毒性應該是脂肪酸不飽和度、碳鏈長度和槐糖部分乙酰化共同作用的結(jié)果。
   對抗宮頸癌活性最好的脂肪酸部分為C18∶1的雙乙酰化內(nèi)酯型槐糖脂組分的體外抗宮頸癌機制進行了深入研究,利用相差顯微鏡、電子顯微鏡及TUNEL等證明了該組分可以誘導HeLa細胞發(fā)生凋亡,流式細胞術檢測細胞周期分布發(fā)現(xiàn),該槐糖脂作用后出現(xiàn)了明顯的二倍體亞峰,且多數(shù)細胞被阻滯在G0期,少部分細胞被阻滯在G2期。利用熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)

10、槐糖脂可以誘導HeLa細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的特異性蛋白CHOP和Bip蛋白的表達,而caspase-12和caspase-3也同樣被激活,說明槐糖脂可以通過ER應激通路來誘導HeLa細胞發(fā)生細胞凋亡。而對線粒體膜電位變化及胞質(zhì)中細胞色素C的含量檢測發(fā)現(xiàn),槐糖脂作用前后二者變化不大,說明線粒體通路可能沒有參與槐糖脂誘導的細胞凋亡。
   建立了小鼠宮頸癌U14細胞的移植瘤模型,以研究槐糖脂的體內(nèi)抗宮頸癌活性,發(fā)現(xiàn)內(nèi)酯型槐糖脂粗品對人宮頸

11、癌裸鼠移植瘤有較好的抑制作用,低、中、高劑量的槐糖脂給藥組抑瘤率分別可以達到15.73%、26.40%和34.83%。并且,槐糖脂在體內(nèi)也可以誘導腫瘤組織發(fā)生細胞凋亡。
   4.主要酯酶/脂肪酶和單加氧酶在槐糖脂合成中的功能的初步研究
   目前,還沒有發(fā)現(xiàn)催化酸型槐糖脂分子形成內(nèi)酯的內(nèi)酯化酶。通常,催化合成內(nèi)酯的酶類可能為硫酯酶或者酯酶/脂肪酶及特定的單加氧酶。本工作利用W.domercqiae基因組注釋及該菌株在硫

12、酸銨和酵母粉兩種條件下基因表達水平的差異對可能完成催化內(nèi)酯化反應的酯酶/脂肪酶及單加氧酶進行了篩選,研究其在槐糖脂合成中的作用。
   首先,建立了W.domercqiae的遺傳操作系統(tǒng):確定潮霉素為抗性篩選標記,甘油三磷酸脫氫酶的啟動子Pgpd可作為外源基因表達的啟動子,電轉(zhuǎn)化的方法可以高效完成外源基因的導入。
   通過基因組及表達譜分析,選取了酵母粉條件下較硫酸銨條件下表達顯著上調(diào)的8個酯酶/脂肪酶基因及4個單加氧

13、酶,利用double-joint PCR的方法成功構建了基因的敲除盒,對這12個基因進行了成功敲除,并對其在槐糖脂合成過程中的功能進行了初步分析。lipB基因可以影響多種槐糖脂組分的合成,△lipB敲除株槐糖脂產(chǎn)量較野生株大幅下降,當以油酸為單一碳源時,△lipB敲除株無法檢測到槐糖脂產(chǎn)生。通過胞外蛋白分析及熒光定量PCR檢測槐糖脂合成過程中關鍵酶的表達情況,推測敲除株產(chǎn)量降低的原因包括兩個方面:菌株內(nèi)與槐糖脂合成相關的關鍵酶的表達量下

14、調(diào);胞外糖苷水解酶含量增加,可能通過水解槐糖脂的糖苷鍵而使槐糖脂產(chǎn)量下降。△moA敲除株所產(chǎn)酸型槐糖脂C18∶2 DASL在總槐糖脂中比例增加而內(nèi)酯型槐糖脂C18∶2 DLSL所占比例則有較大下降,推測moA基因的功能應該是同脂肪酸部分為C18∶2的酸型槐糖脂的內(nèi)酯化相關。moD基因影響了C18∶2 NASL的乙酰化。在以葡萄糖和豆油為底物時,同野生株相比,△lipD、△lipE、△lipF和△lipG敲除株發(fā)酵所得槐糖脂產(chǎn)量均有所降低

15、,槐糖脂中乙?;潭容^高的組分含量降低,而乙?;潭认鄬^低的組分含量增加,推測這種現(xiàn)象的出現(xiàn)是由于脂肪酶/酯酶的缺失使菌株將油脂水解為脂肪酸的能力下降,從而間接影響槐糖脂的合成,同時,脂肪酶可能也有催化槐糖脂乙?;墓δ埽娜笔е禄碧侵阴;潭冉档?而當以葡萄糖和油酸為底物時,由于油酸為單一脂肪酸,這幾個敲除株槐糖脂產(chǎn)量及組成無顯著變化。lipH基因同脂肪酸部分為C18∶2的酸型槐糖脂的內(nèi)酯化有一定關系,并且對菌株將C18∶1整

16、合入槐糖脂的過程也有一定影響。除moA和lipH基因同脂肪酸部分為C18∶2的酸型槐糖脂的內(nèi)酯化相關外,其它幾個基因的敲除多對槐糖脂內(nèi)酯化無顯著影響,推測菌體內(nèi)的內(nèi)酯化酶應有多種。
   5.鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶在擬威克酵母中的異源表達
   為獲得具有更好的生物學活性或表面活性的槐糖脂分子,對槐糖脂的結(jié)構修飾通常是通過化學法或酶催化法進行,而本論文則成功構建了鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶A和B基因(rhlA和rhlB)在W.domercq

17、iae中的表達載體,對W.domercqiae Y2A進行遺傳改造,篩選得到了相應的重組菌株Y2A-2,使其具有表達鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶1的能力。利用HPLC-MS的方法對重組菌株發(fā)酵的糖脂結(jié)構進行鑒定,發(fā)現(xiàn)兩個組分(保留時間分別為16.74和17.47)的分子量分別為554(C26H50O12)和536(C26H48011),前者可能為含1分子葡萄糖、1分子鼠李糖,脂肪酸部分為C14∶0的無乙酰基的酸型糖脂,后者可能是含有兩個鼠李糖的、脂肪

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