刺五加內(nèi)生青霉鯊烯合酶基因的克隆和表達(dá).pdf

1、目的：克隆刺五加（Eleutherococcus senticosus）內(nèi)生真菌青霉（Penicillium minioluteum）的鯊烯合酶基因(Squalene synthase, SS）。構(gòu)建鯊烯合酶基因原核表達(dá)載體，并進(jìn)行原核表達(dá)。利用紅色熒光蛋白，對(duì)鯊烯合酶進(jìn)行定位。分析 SS密碼子的使用方式及其影響因素。
　　方法：經(jīng)過(guò) PCR擴(kuò)增 PmSS的保守序列，5’RACE擴(kuò)增5’端未知序列。經(jīng)過(guò)拼接獲得PmSS的全長(zhǎng)基因序

2、列，并構(gòu)建PmSS基因克隆質(zhì)粒。經(jīng)過(guò)雙酶切PmSS和原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)，連接后，克隆質(zhì)粒經(jīng)過(guò)雙酶切并回收后，將目的片段連接于表達(dá)載體后，轉(zhuǎn)化原核表達(dá)宿主 BL21(DE3)。在不同條件下誘導(dǎo)表達(dá)，篩選適宜的表達(dá)條件，在20℃～37℃的不同的溫度和0.2mmol/L～1.2 mmol/L的不同的IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì) SS蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)蛋白提取試劑盒提取后進(jìn)行SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況。PmSS基因克隆質(zhì)粒通

3、過(guò)雙酶切回收后連接于熒光表達(dá)載體 pEGFP-N1和pDsRed2-N1中，將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 P. minioluteum，以確定SS蛋白的定位。利用codon W、CUSP分析47條來(lái)自不同物種的鯊烯合酶基因并用SPSS16.0軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析、對(duì)應(yīng)性分析對(duì)其進(jìn)行分析，和以MEGA5.0的neighbor-joining連接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行比較。
　　結(jié)果：克隆獲得的PmSS基因全長(zhǎng)為1881 bp，包含1413 b

4、p的開放閱讀框，預(yù)測(cè)的蛋白三維結(jié)構(gòu)包含保守序列和活性氨基酸殘基。構(gòu)建的P. Minioluteum的SS基因的原核表達(dá)載體在原核表達(dá)宿主 BL21(DE3)中進(jìn)行了表達(dá)，同時(shí)對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，在溫度為30℃時(shí)表達(dá)量更高，IPTG誘導(dǎo)濃度為0.6 mmol/L時(shí)表達(dá)量更高。在 P. minioluteum中 SS呈點(diǎn)狀或面狀集中分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。鯊烯合酶基因密碼子1~3位堿基的GC含量（GC1，GC2和GC3）依次為51.33％、34.6

5、5%和54.37%，3個(gè)位點(diǎn)的GC含量均呈極顯著相關(guān)關(guān)系（P<0.01），對(duì)應(yīng)性分析的結(jié)果表明，第1軸顯示30.71%的差異，有效密碼子數(shù)和GC3、GC1和GC2的均值與GC3之間的相關(guān)性均達(dá)極顯著水平（P<0.01）。從不同物種的SS中篩選出的最優(yōu)密碼子為26個(gè)密碼子，第3位堿基均為G或C。以MEGA5.0構(gòu)建的基于鯊烯合酶蛋白質(zhì)序列的進(jìn)化樹和基于 RSCU的聚類分析輸出的樹狀圖相比，不同算法的聚類結(jié)果一致。
　　結(jié)論：實(shí)驗(yàn)成功