黃芪鯊烯合酶基因的克隆.pdf

1、莢膜黃芪為豆科黃芪屬植物，中藥上的黃芪指的是豆科植物膜莢黃芪或蒙古黃芪的干燥根，是我國著名的常用滋補中藥。據(jù)藥典記載，黃芪具有補氣升陽、固表止汗、脫毒生肌、利水脫腫等功效，主治氣虛衰弱、消化力弱、自汗、盜汗、高血壓、糖尿病、水腫及瘡瘍久不收口等癥。
　　 黃芪中含有黃芪皂苷、多糖、黃酮、微量元素和氨基酸等多種有效成分，其中黃芪皂苷是黃芪中主要的主要有效成分之一，具有降壓、抗炎、鎮(zhèn)痛和調(diào)節(jié)代謝等作用。國內(nèi)外對于黃芪的研究，近些年來

2、主要集中在黃芪的化學(xué)成分的提取和鑒定，以及各種化學(xué)成分的藥理作用方面，而黃芪藥用成分的生物合成方面的研究還尚未見報道。其應(yīng)用基礎(chǔ)研究尚很薄弱，特別是其藥用成分黃芪皂苷類化合物的生物合成途徑的相關(guān)基因的研究。因此對黃芪鯊烯合酶的基因克隆對黃芪和鯊烯合酶基因研究有一定的價值。鯊烯合酶，又稱為角鯊烯合酶，能夠催化鯊烯的合成，不僅鯊烯自身的生物活性很強，被廣泛應(yīng)用在醫(yī)療保健品和化妝品等方面，其下游甾體類和皂甙類產(chǎn)物具有重要的生理功能，鯊烯合酶的

3、活性影響類異戊二烯途徑中的其他支路,也關(guān)系到其競爭的半萜類、二萜類等物質(zhì)，因此對于鯊烯合酶的研究越來越深入。
　　 根據(jù)其他物種的鯊烯合酶蛋白中的高度保守序列，并參照其基因序列設(shè)計了一對保守的中間引物和多對兩端引物，通過多次PCR 檢測引物和中間引物擴增的效果，最后確定合適的一對兩端引物。最終從莢膜黃芪中克隆到了鯊烯合酶基因cDNA 序列（GenBank 登錄號HQ829974）。根據(jù)DNAMEN 軟件推測出黃芪鯊烯合酶蛋白序列

4、，通過與豆科植物其他物種的氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)黃芪鯊烯合酶推測的氨基酸序列與大豆鯊烯合酶(BAA22559.1)和百脈根鯊烯合酶（AB102688.1）序列相似性最高，達到了88％，且通過系統(tǒng)發(fā)生樹可以看到黃芪與百脈根進化關(guān)系在比較的幾個物種中最近。對黃芪幼苗根葉莖中鯊烯合酶基因mRNA 進行半定量PCR，結(jié)果表明鯊烯合酶在黃芪根葉莖中表達量是依次降低的。為了以后能夠更方便的進行分離純化黃芪中的鯊烯合酶蛋白，本實驗中針對鯊烯合酶基因疏水片