葫蘆科栝樓屬植物鯊烯合酶SS基因克隆及原核表達.pdf

1、鯊烯合酶(squalene synthase，SS，EC2.5.1.21)是植物甾醇和三萜皂苷生物合成通路過程中的一個關鍵酶，催化著兩分子的法呢酯焦磷酸（FPP）縮合生成鯊烯(SQ)，而鯊烯則在2,3-氧化鯊烯環(huán)化酶催化下，生成三萜、甾醇、膽固醇等重要的植物次生代謝產(chǎn)物。鯊烯合酶SS在鯊烯后續(xù)生物合成通路中處于關鍵地位，其含量和活性決定了后續(xù)產(chǎn)物的合成。因而，近年來人們對鯊烯合酶的研究倍受重視。
　　本研究采用cDNA末端快速擴增

2、技術（RACE）及末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)法，首次分離得到截葉栝樓、栝樓鯊烯合酶SS基因全長cDNA序列，同時對截葉栝樓、栝樓、紅花栝樓SS基因進行了原核表達及生物信息學分析，并對推衍的蛋白質(zhì)性質(zhì)特征進行了比較，為葫蘆科栝樓屬植物三萜合成通路中關鍵酶SS的研究奠定了基礎。本論文的主要研究結(jié)果如下：
　　1、SS基因克?。海?）采用RACE及TdT酶法獲得截葉栝樓的兩個全長cDNA克隆。其cDNA序列全長分別為1983 bp

3、和1902 bp，差異位于編碼區(qū)外的3'UTR，包含一個1254 bp的開放閱讀框序列，編碼417個氨基酸殘基，相對分子量為47.6 kD。（2）采用3'RACE及5'RACE的方法，克隆得到栝樓SS基因cDNA序列，序列長度為1522 bp，其中包括1254 bp的開放讀碼框序列，編碼417個氨基酸殘基，分子量大小約為47.6 kD。
　　2、SS基因序列分析：通過NCBI的Blast比對，發(fā)現(xiàn)截葉栝樓SS基因的核苷酸序列與已知

4、植物SS核苷酸序列的同源性為78％~91%，氨基酸序列同源性為79%~94%；栝樓SS基因的核苷酸序列與已知植物SS核苷酸序列的同源性為78%~93%，氨基酸序列同源性為79%~95%。通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，發(fā)現(xiàn)截葉栝樓、栝樓SS與羅漢果、絞股藍、紅花栝樓、木鱉子的SS親緣關系最近，與植物分類學上的植物親緣關系一致。我們克隆得到的截葉栝樓、栝樓SS的cDNA序列，與葫蘆科植物鯊烯合酶基因的同源性最高，與預測結(jié)果相符合。
　　3、

5、原核表達分析：分別將截葉栝樓、紅花栝樓、栝樓鯊烯合酶基因的編碼序列插入到原核表達載體pET32a(+)中，構(gòu)建的重組原核表達載體pET32a(+)-SS，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，通過IPTG誘導后經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳檢測，電泳結(jié)果表明重組體成功地在BL21(DE3)中表達出約66 kD的融合蛋白，其中pET32a(+)表達標簽大小約為18 kD。
　　本研究成功克隆得到截葉括樓和栝樓鯊烯合酶SS基因的全長cDNA