紅花栝樓、木鱉子鯊烯合酶cDNA的克隆及木鱉子鯊烯合酶的原核表達.pdf

1、本研究采用RT-PCR與RACE相結合的技術對葫蘆科植物紅花栝樓和木鱉子三萜合成通路關鍵酶鯊烯合酶cDNA進行克隆，并對重組的木鱉子鯊烯合酶基因進行原核表達。在此基礎上對紅花栝樓和木鱉子SS基因進行生物信息學分析。主要研究結果如下:
　　(1)獲得紅花栝樓鯊烯合酶基因cDNA序列。所獲得的紅花栝樓鯊烯合酶cDNA序列含有1466個核苷酸，其中包括含有1254個核苷酸的開放讀碼框序列，編碼417個氨基酸殘基。通過NCBI的Blast

2、比對，發(fā)現(xiàn)紅花栝樓SS基因編碼的氨基酸序列與已知植物SS基因編碼的氨基酸序列同源性為78％～94％，核苷酸的同源性為74％～93％。目前通過系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)紅花栝樓與羅漢果、絞股藍的親緣關系最近，這也證實葫蘆科植物鯊烯合酶基因的同源性，與預測結果相符合。同時還發(fā)現(xiàn)葫蘆科植物與金鐵鎖SS基因親緣關系也比較近。根據(jù)NCBI采納的植物分類表，金鐵鎖屬于石竹科。形態(tài)學分類中，葫蘆科與石竹科處于不同分支，但SS的親緣關系需要進一步探討。

3、　　(2)獲得木鱉子鯊烯合酶基因cDNA序列。所獲得的木鱉子鯊烯合酶cDNA基因序列共有1449個核苷酸，其中包括一個含有1254個核苷酸的開放讀碼框序列，編碼417個氨基酸殘基，相對分子量約為47.8 kDa。通過NCBI的Blast比對，發(fā)現(xiàn)木鱉子SS基因編碼的氨基酸序列與已知植物SS基因編碼的氨基酸序列同源性為80％～94％，核苷酸的同源性為73％～92％。系統(tǒng)進化分析表明，木鱉子與紅花栝樓、羅漢果、絞股藍的親緣關系近，進一步證實

4、葫蘆科植物鯊烯合酶基因的同源性，與預期結果相符。
　　(3)木鱉子鯊烯合酶基因原核表達。在得到木鱉子SS基因cDNA序列后，重新設計帶有酶切位點的引物，克隆木鱉子SS基因cDNA讀碼框序列;將SS基因cDNA讀碼框架序列與表達載體pET32a(+)連接，成功構建表達重組質粒pET32a(+)-SS，并在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達出約66 kDa的目的融合蛋白，其中pET32a(+)表達標簽大小約為18.3 kDa。