提高酵母細胞不對稱氧化還原制備手性醇效率的研究.pdf

1、光學活性仲醇是重要的醫(yī)藥和精細化學品中間體，光學純苯基乙二醇(PED)是其中的重要代表，廣泛用于手性藥物、農(nóng)藥和液晶材料的合成。與化學合成法合成手性化合物相比，生物催化劑在位置、化學和立體選擇性上具有獨特優(yōu)勢。其中，微生物去消旋和不對稱還原法由于其理論最大得率100％和操作簡便已經(jīng)成為當今生物催化中前沿領域和熱點內(nèi)容。但這兩類反經(jīng)常遇到的幾個共性問題是底物濃度低，輔酶循環(huán)效率低和催化劑不穩(wěn)定。本論文以酵母細胞催化不對稱氧化還原反應高效合

2、成光學純苯基乙二醇為目標，針對近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）催化PED去消旋和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)不對稱還原α-羥基苯乙酮反應的瓶頸，采取過程控制和介質(zhì)工程手段明顯提高了其反應效率。此外，還揭示了C parapsilosis細胞代謝D-木糖（戊糖）偶聯(lián)去消旋苯基乙二醇過程的作用機理。這些發(fā)現(xiàn)不僅進一步豐富了還原酶手性生物催化理論，而且有助于合成其他精細化學品。主要結(jié)果如

3、下：
　　 (1)以C.parapsilosis細胞催化PED去消旋為模式反應，對可能限制細胞催化活性的因素進行了系統(tǒng)考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)底物濃度高于25g/l或產(chǎn)物濃度高于17.5g/l對該反應產(chǎn)生強烈的抑制作用。較高的底物或產(chǎn)物濃度（如超過30g/l）導致細胞死亡率大于18.3％。此外，在高底物濃度下（如30g/l）NADPH再生也是限制該反應效率的因素之一。
　　 (2)運用樹脂原位底物補料和產(chǎn)物移除“二合一”策略提高去

4、消旋反應的效率。大孔樹脂H103由于吸附容量高和對反應促進最明顯被選作吸附材料。最佳反應條件如下：pH8，溫度30℃，細胞120g/l，樹脂72g/l，轉(zhuǎn)速150r/min。在該條件下30g/lPED反應48h后，產(chǎn)物(S)-PED光學純度和得率分別達到99.2％和93.6％。基于通過異構(gòu)反應實現(xiàn)生物催化去消旋的特點，提出一種合理運用樹脂原位底物補料和產(chǎn)物移除“二合一”策略的方法。該新方法可使C.parapsilosis催化50g/l底

5、物反應90h后，產(chǎn)物e.e值和得率分別高達99.3％和92.0％。
　　 (3)C.parapsilosis催化苯基乙二醇去消旋分批連續(xù)反應中，添加D-木糖有利于細胞代謝活性的恢復，但對催化去消旋關鍵反應的(S)-羰基還原酶活力無影響。在證實細胞內(nèi)存在木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的基礎上，通過磷酸戊糖途徑抑制試驗和直接測定胞內(nèi)NADPH含量相結(jié)合的方法，揭示了C.parapsilosis細胞代謝D-木糖偶聯(lián)去消旋苯基乙二醇過程的作用

6、機理：D-木糖先后經(jīng)過木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的還原和氧化反應生成木酮糖，再經(jīng)木酮糖激酶生成5-磷酸木酮糖并由此進入磷酸戊糖途徑。通過磷酸戊糖途徑中間代謝產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖酸的兩步脫氫反應產(chǎn)生大量NADPH用于去消旋PED，提高反應效率和催化系統(tǒng)的穩(wěn)定性。此外，萃取轉(zhuǎn)化（樹脂/緩沖液體系）和輔酶再生（添加D-木糖）相結(jié)合的策略，不但可以解除底物/產(chǎn)物抑制，還能提高生物催化劑的可持續(xù)性。
　　 (4)通過靶向反應定

7、向篩選成功獲得一株高立體選擇性(e.e＞99.9％)不對稱還原α-羥基苯乙酮合成(R)-PED的酵母S.cerevisiae JUC15。當?shù)孜餄舛葹?g/l時游離細胞重復使用40次，產(chǎn)物得率和光學純度無明顯降低。該催化劑使用廉價的蔗糖作為輔助底物用于輔酶再生，可在相當寬的pH范圍內(nèi)(4-9)催化α-羥基苯乙酮。在所有考察條件下，產(chǎn)物e.e值始終保持大于99.9％。當α-羥基苯乙酮濃度低于其溶解度(11.4g/l)時，產(chǎn)物抑制是不對稱還

8、原反應的主要瓶頸。當?shù)孜餄舛雀哂谄淙芙舛?，尤其是超過20g/l，產(chǎn)物抑制和催化劑失活是引起(R)-苯基乙二醇得率降低的主要原因。此外，S.cerevisiae細胞催化部分產(chǎn)物降解。為克服這些缺點，采取緩沖液和水不溶性有機溶劑組成的原位分離的策略。通過測定不同有機溶劑對底物/產(chǎn)物分配系數(shù)和對不對稱還原反應的影響，篩選出對此反應具有較好促進作用的有機溶劑鄰苯二甲酸二丁酯。在合適的相比例下，產(chǎn)物濃度達到20.7g/l，明顯高于目前已報道的其他