血管細(xì)胞粘附分子-1在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的初步研究.pdf

1、骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是一種多因素所致的慢性進(jìn)行性疾病,諸多因素在其發(fā)生及發(fā)展的過程中起著重要的作用。研究表明,血管細(xì)胞粘附分子-1(Vascularcelladhesionmolecule1,VCAM-1)可能在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中扮演著重要的角色,但其具體作用機(jī)制尚未明確。
　　目的：
　　本研究首先通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)及V

2、CAM-1單克隆抗體的免疫組織化學(xué)染色,對(duì)正常人及骨關(guān)節(jié)炎患者的血清、關(guān)節(jié)滑膜及軟骨組織中的VCAM-1進(jìn)行測(cè)定并比較。其次研究人正常軟骨細(xì)胞與骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定,對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行對(duì)照并評(píng)價(jià)其生物學(xué)活性,為進(jìn)一步研究人軟骨細(xì)胞的其他生物學(xué)特性及骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。并且通過RT-PCR及Westernblot實(shí)驗(yàn),從細(xì)胞的基因及蛋白水平對(duì)所獲得的人正常及骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的VCAM-1的表達(dá)進(jìn)行比較,并對(duì)不

3、同濃度IL-1β作用下人正常軟骨細(xì)胞的VCAM-1的表達(dá)進(jìn)行比較,初步探討VCAM-1在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的作用,為進(jìn)一步揭示VCAM-1在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的具體作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.采用ELISA法分別對(duì)正常人及骨關(guān)節(jié)炎患者血清中的VCAM-1的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定;對(duì)正常及骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑膜及軟骨組織進(jìn)行VCAM-1單克隆抗體免疫組織化學(xué)染色。
　　2.取人創(chuàng)傷性截肢的正常無菌膝關(guān)節(jié)軟骨與骨關(guān)節(jié)炎全

4、膝置換的膝關(guān)節(jié)軟骨,采用兩步酶消化法分離得到軟骨細(xì)胞,分別進(jìn)行體外培養(yǎng)并傳代。通過倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),繪制生長(zhǎng)曲線,測(cè)細(xì)胞增殖,甲苯胺藍(lán)染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色對(duì)各代人正常軟骨細(xì)胞與骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　3.通過RT-PCR檢測(cè)VCAM-1mRNA以及Westernblot檢測(cè)VCAM-1蛋白,對(duì)所獲得的人正常及骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中VCAM-1的表達(dá)進(jìn)行比較。
　　4.通過RT-PCR及Western

5、blot實(shí)驗(yàn),從細(xì)胞的基因及蛋白水平對(duì)不同濃度IL-1β作用下人正常軟骨細(xì)胞的VCAM-1的表達(dá)進(jìn)行比較。
　　結(jié)果：
　　1.各級(jí)骨關(guān)節(jié)炎患者的血清中VCAM-1的表達(dá)量都明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)。并且隨著骨關(guān)節(jié)炎程度的加重而增高。
　　2.骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑膜及軟骨組織中VCAM-1單克隆抗體免疫組織化學(xué)染色呈陽(yáng)性,且隨著病變程度的加重,著色加深。各級(jí)骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨中VCAM-1的表達(dá)都明顯高于正

6、常對(duì)照組(P<0.05),而且骨關(guān)節(jié)炎患者各級(jí)間VCAM-1的表達(dá)也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),表明VCAM-1的表達(dá)量也隨著骨關(guān)節(jié)炎程度的加重而增高。
　　3.經(jīng)過兩步酶消化法分離的原代正常軟骨細(xì)胞為球形,培養(yǎng)2-3天,細(xì)胞貼壁、變形,呈三角形或多角形,1周后細(xì)胞增殖明顯,約2周左右,細(xì)胞融合成層。傳代后第1代細(xì)胞貼壁時(shí)間較原代細(xì)胞短,增殖速度加快。但隨傳代次數(shù)增加,增殖速度漸減慢,細(xì)胞形態(tài)逐漸向“纖維樣”細(xì)胞轉(zhuǎn)化。而骨關(guān)節(jié)

7、炎軟骨細(xì)胞形態(tài)似成纖維細(xì)胞,生長(zhǎng)速度明顯較正常軟骨細(xì)胞慢。
　　4.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,正常軟骨細(xì)胞5代以內(nèi)的生長(zhǎng)曲線呈“S”型。而骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖低于正常組,傳至第4代其生物學(xué)特征已基本消失。
　　5.甲苯胺藍(lán)染色顯示,正常軟骨細(xì)胞內(nèi)可見藍(lán)紫色異染顆粒,細(xì)胞周圍有少量的異染顆粒出現(xiàn)。經(jīng)多次傳代培養(yǎng)后,軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色正染呈淺藍(lán)色。而骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞以正染藍(lán)色為主,經(jīng)多次傳代后細(xì)胞基本無藍(lán)色。
　　6.Ⅱ型膠原

8、免疫組織化學(xué)染色顯示,正常原代軟骨細(xì)胞著色為棕黃色,呈陽(yáng)性,細(xì)胞核周圍呈黃褐色,可見黃褐色顆粒在細(xì)胞周圍。細(xì)胞經(jīng)傳代后棕黃色著色漸減弱,5代以后軟骨細(xì)胞呈成纖維化,突起增多,染色變淡。而骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞原代染色為棕黃色,經(jīng)多次傳代后基本無棕黃色著色。
　　7.所獲得的人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中VCAM-1mRNA的量及蛋白的表達(dá)量明顯較正常軟骨細(xì)胞高。
　　8.IL-1β干預(yù)組的人正常軟骨細(xì)胞中VCAM-1mRNA的量以及VCAM

9、-1的蛋白量表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組,且隨IL-1β濃度增加,其亦有增高的趨勢(shì)。
　　結(jié)論：
　　1.血清、關(guān)節(jié)滑膜及軟骨組織中VCAM-1的表達(dá)與骨關(guān)節(jié)炎密切相關(guān),且隨病變的加重其表達(dá)量增加。
　　2.采用胰蛋白酶及Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化法可以獲得人正常及骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。正常軟骨細(xì)胞5代以內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)良好,生物學(xué)特性明顯,適合于實(shí)驗(yàn)研究,5代以后出現(xiàn)去分化現(xiàn)象;骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖慢,生物學(xué)特征退變?cè)?符合軟骨細(xì)胞退變

10、的表現(xiàn)。這為骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞水平的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　3.人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞VCAM-1的表達(dá)明顯高于正常軟骨細(xì)胞,證實(shí)了本研究中所獲得的細(xì)胞具有代表性,可以作為后續(xù)研究骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的模型細(xì)胞,為下一步揭示VCAM-1在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的具體作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　4.IL-1β干預(yù)組的人正常軟骨細(xì)胞中VCAM-1的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組,且隨IL-1β濃度增加,其亦有增高的趨勢(shì)。這一結(jié)果證實(shí)了VCAM-1的