先天性靜止性夜盲大鼠視覺信號特征及其視覺信號傳導(dǎo)通路重塑.pdf

1、先天性靜止性夜盲(congenital stationary night blindness,CSNB)是一種非進展性、以視桿視覺信號系統(tǒng)功能障礙為主的遺傳性視網(wǎng)膜病。我們實驗室發(fā)現(xiàn)的Cacnalf基因自然突變CSNB大鼠,其電生理及行為學(xué)證明其克服了基因工程誘導(dǎo)突變動物模式與臨床實際差異較大的缺陷,因此可以作為研究CSNB發(fā)病機制及視網(wǎng)膜信號通路之間相互關(guān)系的一種有效模型。Cavl.4型鈣通道為L.型鈣通道的亞型之一,其主要的功能單位

2、Olf亞基由Cacnalf基因編碼。目前發(fā)現(xiàn)Cacnalf基因多種位點突變可損傷視桿和視錐信號傳導(dǎo)通路,并與性染色體遺傳的不完全型靜止性夜盲密切相關(guān)。研究已證實Cacnalf基因突變導(dǎo)致的alf亞基缺陷可使光感受器細胞帶狀突觸數(shù)量、形態(tài)以及功能發(fā)生異常,從而引發(fā)光感受器細胞與二級神經(jīng)元之間視覺信號傳導(dǎo)障礙。
　　近期形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),自然突變CSNB大鼠視網(wǎng)膜雙極細胞所發(fā)出的異常突觸可伸及外核層外部,外叢狀層厚度減少,水平細胞數(shù)目減

3、少,而視網(wǎng)膜內(nèi)層的超微結(jié)構(gòu)則相對正常完整。上述視網(wǎng)膜外層發(fā)生的形態(tài)學(xué)變化很可能影響視網(wǎng)膜內(nèi)層的視覺信號通路的傳導(dǎo)整合功能。然而,CSNB動物視網(wǎng)膜外層所發(fā)生的形態(tài)學(xué)變化及神經(jīng)遞質(zhì)釋放功能障礙對視網(wǎng)膜最內(nèi)層的神經(jīng)節(jié)細胞會產(chǎn)生何種病理學(xué)效應(yīng),至今未見諸于報道。
　　多電極陣列系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于視網(wǎng)膜神經(jīng)元電生理活動記錄等實驗研究,由于其具備完整性、非侵入性的優(yōu)點,因而此電生理實驗技術(shù)彌補了傳統(tǒng)的活體外記錄與復(fù)雜的活體內(nèi)記錄的先天缺陷,目

4、前已經(jīng)被應(yīng)用于記錄監(jiān)測光感受器細胞、神經(jīng)節(jié)細胞等視網(wǎng)膜神經(jīng)元的生理活動。本研究采用多電極陣列記錄系統(tǒng)和先天性自然突變大鼠動物模型,根據(jù)其視網(wǎng)膜內(nèi)層信號通路的視覺電生理信號所發(fā)生的特征性改變來證明其信號通路發(fā)生的重塑,并以此為基礎(chǔ)闡明通路重塑的發(fā)生機制,為進一步制訂治療方案及采取針對性的視覺干預(yù)保護措施提供依據(jù)。
　　材料與方法
　　實驗采用近交系CSNB大鼠(SPF級,F23,8~10周齡)及正常同齡對照Wt大鼠,將大鼠暗適

5、應(yīng)12-15小時,深度麻醉后處死大鼠摘取眼球,除去眼前節(jié)和視網(wǎng)膜色素上皮層,制備視網(wǎng)膜鋪片,并將其神經(jīng)節(jié)細胞面向下貼附于多電極陣列記錄芯片,并使其適應(yīng)生物記錄芯片中的灌流環(huán)境。藥理學(xué)實驗環(huán)節(jié)中,實驗中所涉及的藥品經(jīng)活性灌注系統(tǒng)進入灌流液。電腦刺激器控制的發(fā)光二級管所產(chǎn)生的白光經(jīng)透鏡系統(tǒng)匯聚形成光斑,投射到生物芯片灌流槽之中的視網(wǎng)膜鋪片上,給予其同步全野光刺激。多電極陣列系統(tǒng)電極所采集到的神經(jīng)元電信號經(jīng)過放大器過濾并放大,存儲于電腦系統(tǒng)供

6、后續(xù)離線軟件分析處理。單電極所采集的電生理信號進行放電分析時,其檢測閾值設(shè)定為平均幅值的四倍標(biāo)準差。然后應(yīng)用Offline Sorter將備選放電波形進行處理,采取其前三個主要組成部分應(yīng)用NeuroExplore軟件進行后續(xù)分析:51.4％,CSNB:36.8%;P<0.01)。CSNB大鼠視網(wǎng)膜混合型放電神經(jīng)節(jié)細胞的放電總數(shù)(246553個,n=20)顯著高于Wt大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞混合混合型放電細胞的放電總數(shù)(112089,n=20

7、P<0.01)。CSNB大鼠和Wt大鼠視網(wǎng)膜其它三種神經(jīng)節(jié)細胞的放電總數(shù)無顯著差異(P>0.05)。5-野生型SD大鼠與CSNB大鼠視網(wǎng)膜光誘導(dǎo)放電反應(yīng)
　　按照對光反應(yīng)的放電特征可將來自CSNB大鼠和Wt大鼠視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細胞分為六大類:1)給光型(ON-型);2)撤光型(OFF-型);3)給.撤光型(ON-OFF型);4)持續(xù)給光型(sustained ON型);5)持續(xù)給。撤光型(sustained ON-OFF型);6)延

8、遲撤光型(delayed OFF型)。CSNB大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞光誘導(dǎo)放電反應(yīng)的平均頻率(16.40±9.97Hz,n=340)較野生型大鼠顯著降低(38.62±11.78Hz,n=373, P　　6.野生型SD大鼠與CSNB大鼠視網(wǎng)膜自發(fā)放電的互相關(guān)活

9、動
　　在野生型大鼠視網(wǎng)膜中,觀察到三種特征性神經(jīng)節(jié)細胞互相關(guān)活動類型:短時程互相關(guān)活動、中時程互相關(guān)活動和長時程互相關(guān)活動。而在CSNB大鼠視網(wǎng)膜記錄數(shù)據(jù)中只觀察到短時程互相關(guān)活動和中時程互相關(guān)活動,長時程互相關(guān)活動消缺失(n=20)。應(yīng)用100 UM18p-GA可明顯降低CSNB大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的自發(fā)性放電頻率,而其對野生型大鼠視網(wǎng)膜的放電頻率無明顯影響(n=5)。
　　7.CSNB大鼠視網(wǎng)膜視覺信號傳導(dǎo)通路的重塑<

10、br>　　按照單個神經(jīng)節(jié)細胞ON-型放電反應(yīng)頻率占其光誘導(dǎo)放電反應(yīng)總頻率的比例,將其歸為三類:1)ON反應(yīng)主導(dǎo)型神經(jīng)節(jié)細胞(比率>0.5);2)OFF反應(yīng)主導(dǎo)型神經(jīng)節(jié)細胞(比率<0.5);3)均衡反應(yīng)型神經(jīng)節(jié)細胞(比率=0.5)。較野生型大鼠,CSNB大鼠視網(wǎng)膜中的OFF反應(yīng)主導(dǎo)型神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)占光誘導(dǎo)放電神經(jīng)節(jié)細胞總數(shù)的比例增加(Wt:60.6%; CSNB:78.1%),而ON反應(yīng)主導(dǎo)型神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)所占的比例減小（Wt:31.5%;

11、CSNB:18.2%)。對照兩種大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞光誘導(dǎo)ON-型和OFF-型反應(yīng)的潛伏期發(fā)現(xiàn):CSNB大鼠的ON-型和OFF-型反應(yīng)潛伏期均較野生型大鼠顯著延長(P<0.05)。應(yīng)用用CNQX+PDA可明顯阻斷CSNB大鼠和野生型大鼠視網(wǎng)膜光誘導(dǎo)OFF-型反應(yīng):在兩種視網(wǎng)膜中,撤光型神經(jīng)節(jié)細胞(OFF RGCs)和給光.撤光型神經(jīng)節(jié)細胞（ON-OFF RGCs)的OFF反應(yīng)均可被阻斷劑消除,而延遲撤光型神經(jīng)節(jié)細胞（delayed OF

12、F RGCs)和持續(xù)給光.撤光型神經(jīng)節(jié)細胞的OFF反應(yīng)無顯著變化。施加藥物雞尾酒后,在CSNB大鼠視網(wǎng)膜中,光誘導(dǎo)神經(jīng)節(jié)細胞放電反應(yīng)的平均頻率降低而ON-型反應(yīng)平均頻率增加P<0.01),且ON-型反應(yīng)的潛伏期顯著減小(P<0.05); Wt大鼠視網(wǎng)膜中的光誘導(dǎo)神經(jīng)節(jié)細胞放電反應(yīng)的平均頻率降低,但ON-型反應(yīng)的平均頻率和潛伏期無顯著變化(P>0.05)。
　　結(jié)論
　　1.在視網(wǎng)膜光誘發(fā)反應(yīng)場電位記錄中,CSNB大鼠視網(wǎng)膜光

13、誘發(fā)場電位仍可記錄到a.波,盡管其峰值顯著減小,說明CSNB大鼠光感受器細胞至少保存了部分活性和功能;其光誘發(fā)場電位波形中b.波缺失表明CSNB大鼠視網(wǎng)膜視覺信號傳導(dǎo)在第一級神經(jīng)元與第二級神經(jīng)元之間發(fā)生嚴重障礙。
　　2.在電刺激放電反應(yīng)記錄中,CSNB大鼠視網(wǎng)膜的長潛伏期反應(yīng)的放電頻率較野生型大鼠降低,表明CacNaLF基因突變后來源于視網(wǎng)膜外層的間接突觸刺激驅(qū)動減少。
　　3.CSNB大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞自發(fā)放電的頻率升

14、高表明:雖然CSNB大鼠視網(wǎng)膜外層視覺信號傳導(dǎo)發(fā)生障礙且光感受器細胞功能存在缺陷,但其視網(wǎng)膜內(nèi)層的自發(fā)性電生理活動亢進。
　　4.CSNB大鼠視網(wǎng)膜混合型放電細胞占所有自發(fā)放電神經(jīng)節(jié)細胞的比重升高,且混合型放電細胞的放電總數(shù)顯著增加,因此可以判定活躍的混合型放電細胞是CSNB大鼠視網(wǎng)膜自發(fā)性電生理活動亢進的主要原因。
　　5.信號/噪聲比下降表明CSNB大鼠視網(wǎng)膜分離有效視覺信號與背景噪聲的反應(yīng)能力降低,其神經(jīng)節(jié)細胞處理編碼

15、視覺信號的有效度和可信度發(fā)生缺陷,且直接影響到視網(wǎng)膜視覺信號傳通路的效率。
　　6.CSNB大鼠視網(wǎng)膜記錄數(shù)據(jù)中長時程互相關(guān)活動消缺失,可能是其視網(wǎng)膜 L.型鈣通道失功能導(dǎo)致化學(xué)遞質(zhì)釋放障礙導(dǎo)致視網(wǎng)膜外層的多突觸環(huán)路信息輸入減少或消失所造成。隙連接在CSNB大鼠視網(wǎng)膜中神經(jīng)元協(xié)同放電活動中發(fā)揮重要作用,且其表達水平或活性功能發(fā)生上調(diào)。
　　7.CSNB大鼠視網(wǎng)膜光感受器細胞和ON-型雙極細胞發(fā)生視覺信號傳導(dǎo)障礙后,其下游的視