先天性靜止性夜盲大鼠視桿雙極細胞L-鈣通道電生理特征.pdf

1、先天性靜止性夜盲(congenital stationary night blindness，CSNB)是一類先天性、非進展性、以視網膜視桿信號系統(tǒng)功能障礙為主的眼科疾病，其發(fā)病機制尚不完全明確，且缺乏有效治療手段。我們實驗室發(fā)現(xiàn)的一種CSNB模式大鼠為編碼L-鈣通道的Cacna1f基因自然突變所致，主要影響視網膜視桿信號系統(tǒng)，電生理及行為學證明其克服了基因工程誘導模式動物與臨床實際差異較大的缺陷，因此可以作為研究CSNB發(fā)病機制及視網

2、膜信號回路之間關系的一種新模型。以往研究工作主要集中在視網膜第一級神經元水平（視桿細胞），推測其發(fā)病機制為視桿細胞突觸末端膜鈣通道功能障礙，后者對含遞質囊泡釋放產生影響，導致視覺信號傳導受限而發(fā)病。該通道在視桿雙極細胞（rod bipolar cells,RBCs）中也有表達，其在CSNB發(fā)病中的作用尚未見文獻報道。
　　鑒于雙極細胞在視覺信號轉導，以及視桿與視錐回路間相互作用中起著非常重要的作用，本實驗采用利用全細胞膜片鉗技術對

3、本實驗室培育的CSNB大鼠RBCsL-鈣通道電生理學和通道藥理學特征進行觀察，并探討其與視網膜視覺信號傳遞障礙之間的聯(lián)系。脊椎動物視網膜有非常相似的解剖結構和生理機能，不同動物的實驗結果種群變異性很小，因此研究CSNB鈣通道電流特征可為進一步明確這種疾病的發(fā)病機制及采取針對性的視覺干預保護措施提供依據。
　　材料與方法：
　　實驗采用本實驗室鑒定發(fā)現(xiàn)，并建立近交系的CSNB大鼠（F20/F21,4～8周齡）及正常同齡對照SD

4、大鼠，深度麻醉后處死大鼠摘取眼球，利用手動切片機制作視網膜切片，在紅外干涉顯微成像系統(tǒng)中尋找RBCs胞體，運用全細胞膜片鉗模式記錄L-鈣通道電流；給細胞施加階躍刺激（從-60mV除極至0mV，時程200ms），記錄程序刺激后細胞靜息膜電容（restCm）的變化值（△Cm），并據此計算胞吐系數EI（Exocytotic index）；分別施加L-鈣通道阻斷劑nifedipine和GABA受體阻斷劑PTX來觀察通道的藥理學特征；用應用Axo

5、n公司的pClamp8．1軟件進行數據測量分析，獲取RBCsL-鈣通道電生理學指標。在Clampfit上選取有代表性的實驗記錄,導入到Origin軟件進行分析和作圖。
　　結果：
　　1.RBCsL-鈣通道電流特征
　　給細胞施加階躍刺激和斜坡刺激后，在SD組和CSNB組大鼠的RBCs中均可記錄出內向電流，其電生理學特征符合L-鈣通道電流特點：在較高除極電位激活；失活緩慢；載流離子為Ca2+:用同等濃度Mg2+代替灌流

6、液中的Ca2+，未能記錄到類似電流。
　　2.L-鈣通道藥理學特性
　　特異性L-鈣通道阻斷劑nifedipine（10μm）可以完全阻斷SD組和CSNB組所記錄的內向電流。結合其電生理學特征我們可以判定本實驗在RBCs所記錄到的內向電流為L型鈣通道電流。
　　3.SD大鼠與CSNB大鼠RBCsL-鈣通道電流比較
　　SD組大鼠RBCsL-鈣通道于-40mV左右開放，通道電流于-20和-30mV之間達到峰值：-3

7、3.2±2.5pA（n=20）。CSNB組大鼠RBCsL-鈣通道于-20mV和-30mV之間開始激活，通道電流于-15mV左右達峰，峰值為12.2±2.3pA(n=23)。
　　4.SD大鼠視網膜RBCs的負反饋電流
　　SD組較強程度除極（-20m和-30mv）時可在Ca2+電流上發(fā)現(xiàn)較小的外向的電流（n=11），電流大小與細胞在切片中的位置有關，位置越深外向電流越大。應用GABAA和GABAC受體阻斷劑PTX（100μm

8、）能夠明顯阻斷這種外向電流，提示其為為RBCs的突觸前GABAA和GABAC受體介導的抑制性突觸后電流（inhibitorypostsynapticcurrent，IPSCS）。而在CSNB組所有記錄細胞中均未發(fā)現(xiàn)此種外向電流。
　　5．SD大鼠與CSNB大鼠RBCs胞吐指數差異
　　給細胞施加階躍刺激（從-60mV除極至0mV，時程200ms），記錄程序刺激后restCm的變化值（△Cm）,并據此計算胞吐系數EI：SD組大

9、鼠restCm為：4146.600±544.202fF,△Cm為29.600±7.472fF，EI：0.723±0.199；CSNB組大鼠restCm為：4356.957±549.493，△Cm為12.348±6.919，EI為0.291±0.173。SD組大鼠△Cm較CSNB組大鼠高，EI較CSNB組大鼠大，有明顯差異（p<0.01）與對照組比較，CSNB大鼠的△Cm和EI明顯降低（p<0.01）。
　　結論：
　　1.實

10、驗在CSNB組和SD組大鼠RBCs中所記錄的電流為L-鈣通電流；CSNB組大鼠RBCsL-鈣通電流峰值明顯小于SD組大鼠，推測CSNB大鼠電流強度降低導致胞內，尤其是突觸終末的Ca2+濃度降低,難以達到觸發(fā)正常速率神經遞質釋放所需要的濃度，因此可能會使突觸終末神經遞質釋放發(fā)生障礙，從而影響視覺信號向下一級神經元傳導。
　　2.CSNB組大鼠I-V曲線較SD組右移大約20mV，會導致通道在雙極細胞暗適應生理電位范圍（-70mV—-2

11、0mV）內難以除極化。
　　3.CSNB大鼠RBCs的突觸前GABAA和GABAC受體介導的抑制性突觸后電流（IPSCS）消失，提示其觸終末神經遞質釋放過程發(fā)生障礙，難以觸發(fā)來自AⅡACs的負反饋。這種負反饋障礙會影響rod視覺信號局部突觸環(huán)路放大機制和視覺信號向神經節(jié)細胞傳導的可塑性。
　　4．CSNB大鼠胞吐系數EI明顯降低，說明CSNB組大鼠RBCs因為鈣內流導致遞質囊泡和細胞膜融合，使細胞膜表面積（胞吐系數）增加的程