人胰島素突變體的分子設計與克隆.pdf

1、糖尿病是現(xiàn)今危害人類健康與生命的一大疾病?；颊唧w重減輕、形體消瘦，嚴重者體重可下降數(shù)十斤，以致疲乏無力，精神不振。糖尿病也引發(fā)多種并發(fā)癥，如心臟、腎臟、血管、神經(jīng)、視網(wǎng)膜的病變，給病人帶來了極大痛苦。胰島素作為機體內唯一降血糖的激素，對于糖尿病的治療有著極為關鍵的作用。市場上的胰島素制劑，傳統(tǒng)生產(chǎn)方法的主要來源是豬胰島素、牛胰島素。因為二者與人胰島素的一級結構有所不同，可能會產(chǎn)生免疫排異，進而影響活性，且產(chǎn)量較低，很難滿足市場供應。所以

2、現(xiàn)今，以基因工程方法生產(chǎn)胰島素來取代傳統(tǒng)的方法已成為主要趨勢。另一方面，糖尿病患者的主要用藥方式是注射，一天多次的注射給患者帶來很大不便。所以開發(fā)其它用藥方式的胰島素，如吸入、貼片、口服胰島素也是當今研究的一個熱點。
　　 本研究的目的是設計與克隆短C肽胰島素突變體，為日后研究其活性打好基礎，并探究人胰島素原對馬鈴薯的遺傳轉化的優(yōu)化條件。以美國國家基因庫(Genbank)發(fā)布的人胰島素原的氨基酸序列為模板，參考大腸桿菌表達系統(tǒng)的

3、密碼子偏好性和表達載體pGEX-3X的特點，設計適合大腸桿菌表達的人胰島素原基因，并在B鏈N端上游添加EcoRI酶切位點，在A鏈C端下游添加BamHI酶切位點。C肽部分用一短四肽代替。整個基因設計成6個互相部分重疊的片段，并分段合成。T-A克隆得到人胰島素突變體基因。另外，本實驗也嘗試了將實驗室構建的植物表達載體p1301P06H轉化農(nóng)桿菌，并用幾種不同方法以農(nóng)桿菌介導轉化馬鈴薯。實驗的結果總結如下：
　　 (1)完成人胰島素突

4、變體InsM2的分子設計。
　　 (2)分段合成所設計的基因片段，使用套疊式PCR方法，結合Klenow片段處理，體外延伸獲得完整的適合在大腸桿菌中表達的人胰島素突變體InsM2的基因。并摸索出最佳擴增條件為退火溫度為60℃、65℃、70℃的梯度PCR。
　　 (3)凝膠回收到經(jīng)純化的片段。片段通過粘性末端TA克隆到T載體pMD-19 simple T-Vector上。經(jīng)過篩選，得到陽性菌株，經(jīng)測序，結果有兩個核苷酸與預

5、期相比發(fā)生突變，但是所編碼的氨基酸未發(fā)生改變。
　　 (4)分別使用馬鈴薯費烏瑞它的莖段、葉片、莖尖、塊莖上生長的芽、以及剛剛萌發(fā)的小型馬鈴薯塊莖作為材料，結合葉盤法、真空滲透法、超聲法，對馬鈴薯進行轉化。最終得到對費烏瑞它的轉化最佳條件是使用莖尖法，抽真空到0.04MPa維持2.5min后恢復常壓，重復三次，在含有乙酰丁香酮的共培養(yǎng)基中共培養(yǎng)3天，經(jīng)篩選獲得在含有潮霉素的抗性培養(yǎng)基中生根的植株，有待進一步使用分子生物學方法檢驗