小檗堿促進胰島素分泌改善胰島素抵抗的分子機制.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：小檗堿對NIT-1細胞胰島素分泌及葡萄糖激酶活性的影響
　　 目的：
　　 觀察小檗堿對NIT-1細胞在不同濃度葡萄糖刺激下胰島素分泌的影響，檢測小檗堿對葡萄糖激酶活性及表達的影響，以初步闡明小檗堿在體外促進胰島素分泌的可能機制。
　　 方法：
　　 將NIT-1細胞在含不同濃度葡萄糖（高濃度 (16.5 mM)，低濃度 (5.5 mM)）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并用不

2、同濃度小檗堿干預，選用生物素作為陽性對照藥。用放免法檢測胰島素濃度，液體閃爍計數(shù)法檢測葡萄糖利用，生物發(fā)光技術檢測ATP含量，酶法分析檢測葡萄糖激酶活性，Western blot檢測葡萄糖激酶（GK）和葡萄糖激酶調節(jié)蛋白(GKRP)在蛋白水平表達的變化，并用免疫熒光技術檢測葡萄糖激酶在細胞核內(nèi)外轉移。
　　 結果：
　　 在高濃度葡萄糖刺激下，與空白對照組相比較，小檗堿能使葡萄糖刺激下NIT-1細胞胰島素分泌水平升高，葡

3、萄糖利用增強，ATP含量增加，GK活性提高；同時，小檗堿能使細胞內(nèi)GK表達增加而GKRP表達減少，還能使GK在細胞漿內(nèi)的表達增加，小檗堿的這些生物學效應與已被證實的葡萄激酶激活劑生物素相比較無顯著差異。在低濃度葡萄糖刺激，小檗堿和生物素的上述活性與空白對照組比較無顯著差異。
　　 結論：
　　 小檗堿能促進NIT-1細胞在高濃度葡萄糖刺激下的胰島素分泌；這種效應的可能機制是：小檗堿作為GK激活劑，使GK表達增強而GKRP

4、表達減少，促進GK向細胞核外轉運，從而使GK活性增強，最終使胰島素分泌增強。
　　 第二部分：小檗堿改善高糖高脂飲食加小劑量STZ誘導的2型糖尿病大鼠靶組織內(nèi)質網(wǎng)應激的研究
　　 目的：
　　 建立高糖高脂飲食加小劑量STZ誘導的2型糖尿病大鼠模型，觀察小檗堿對2型糖尿病大鼠糖脂代謝的影響，同時檢測肝臟和脂肪組織中內(nèi)質網(wǎng)應激相關分子和胰島素信號轉導相關蛋白表達的影響，以探討小檗堿改善胰島素抵抗、治療2型糖尿病的分

5、子機制。
　　 方法：
　　 采用高糖高脂飲食喂養(yǎng)加尾靜脈注射小劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，15mg/kg）的方法建立2型糖尿病大鼠模型，將造模動物隨機分為模型組、小檗堿組、4-苯基丁酸組，另設正常對照組。藥物干預治療6周后，進行口服糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）并檢測各組動物空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、空腹血清

6、胰島素（fasting serum insulin，F(xiàn)INS）、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白值，并用Western blot檢測各組大鼠肝臟和脂肪組織中總JNK和c-Jun-磷酸化水平、總IRS-1和AKT蛋白及磷酸化的水平，用RT-PCR檢測GRP78和ORP150基因轉錄水平。
　　 結果：
　　 與模型組比較，小檗堿能顯著改善大鼠OGTT，降低FBG，升高FIN，使總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白

7、顯著降低，而高密度脂蛋白升高；同時，大鼠肝臟和脂肪組織中JNK活性降低，而GRP78和ORP150基因轉錄水平顯著下調，小檗堿還能使外周組織胰島素刺激后IRS-1 Ser307 磷酸化水平下調，而AKT Ser473 磷酸化水平升高；小檗堿的上述效應與已被證實的具有改善內(nèi)質網(wǎng)應激的4-苯基丁酸治療組相比無顯著差異。
　　 結論：
　　 小檗堿通過減緩2型糖尿病大鼠肝臟和脂肪組織內(nèi)質網(wǎng)應激并改善胰島素信號轉導從而發(fā)揮降糖降

8、脂的生物學活性。
　　 第三部分：小檗堿對衣霉素誘導的肝細胞內(nèi)質網(wǎng)應激和胰島素信號轉導的影響
　　 目的：
　　 建立衣霉素誘導肝細胞內(nèi)質網(wǎng)應激的細胞模型，研究小檗堿對肝細胞葡萄糖代謝的效應，并檢測小檗堿對內(nèi)質網(wǎng)應激標志物JNK活性和胰島素信號轉導相關蛋白的影響，探討小檗堿改善胰島素抵抗的分子機制。
　　 方法：
　　 分別以0.5μg/ml或2.0μg/ml衣霉素作用于Hep G2肝細胞誘導產(chǎn)生

9、內(nèi)質網(wǎng)應激，并予以小檗堿預處理，同時選用4-苯基丁酸作為陽性對照藥，分別用葡萄糖氧化酶法檢測培養(yǎng)液中葡萄糖消耗和葡萄糖合成水平，Western blot檢測JNK和c-Jun-磷酸化表達水平，總IRS-1和AKT蛋白表達及其磷酸化水平；并用real time-PCR檢測小檗堿對Hep G2細胞內(nèi)質網(wǎng)應激狀態(tài)下GRP78和ORP150基因表達的影響。
　　 結果：
　　 與模型組比較，小檗堿能顯著改善Hep G2細胞胰島素

10、刺激下葡萄糖消耗，抑制肝細胞葡萄糖合成，并使JNK活性降低、而使GRP78和ORP150基因表達顯著降低，同時，小檗堿能使IRS-1 Ser307 磷酸化水平減少，而使AKT Ser473 磷酸化水平增加；小檗堿的上述生物學效應與4-苯基丁酸治療組相比無顯著差異。
　　 結論：
　　 小檗堿可以明顯改善衣霉素誘導的Hep G2細胞內(nèi)質網(wǎng)應激和胰島素抵抗，其分子機制可能與小檗堿阻斷JNK的激活，抑制內(nèi)質網(wǎng)應激伴侶分子GRP