基于分子對(duì)接研究獨(dú)活寄生湯治療骨性關(guān)節(jié)炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用靶點(diǎn).pdf

1、目的：
　　探討?yīng)毣罴纳鷾委煿切躁P(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1.從中藥原植物化學(xué)成分手冊(cè)、北京大學(xué)中草藥有效成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)中，搜索獨(dú)活寄生湯化學(xué)成分，構(gòu)建獨(dú)活寄生湯化學(xué)成分分子數(shù)據(jù)庫(kù);通過(guò)Discovery Studio(DS)的分子對(duì)接平臺(tái)，選取已經(jīng)明確的OA治療靶點(diǎn)蛋白聚糖酶1(ADAMTS-4)、蛋白聚糖酶2(ADAMTS-5)、基質(zhì)金屬酶(MMP)

2、-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-11、MMP-13、環(huán)氧化酶-2（COX-2）、人核因子κB抑制物激酶β(IKK-β)和5-脂氧合酶(5-LOX)為受體，對(duì)獨(dú)活寄生湯化學(xué)成分進(jìn)行虛擬篩選，預(yù)測(cè)獨(dú)活寄生湯治療OA的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用靶點(diǎn)。
　　2.以獨(dú)活寄生湯治療OA的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為研究對(duì)象，借助DS軟件的定量構(gòu)效關(guān)系和主成分分析平臺(tái)，描述其化學(xué)空間。通過(guò)與已經(jīng)批準(zhǔn)治療OA的藥物比較，研究獨(dú)

3、活寄生湯治療OA的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)化學(xué)空間特征;借助Cytoscape2.8.3軟件的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析平臺(tái)，構(gòu)建獨(dú)活寄生湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)和靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，研究獨(dú)活寄生湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的作用網(wǎng)絡(luò)特征。
　　3.采用血清藥理學(xué)方法，將健康2月齡清潔級(jí)SD雄性大鼠36只，隨機(jī)分為生理鹽水組、壯骨關(guān)節(jié)丸組和獨(dú)活寄生湯組，每組各12只。分別給予相對(duì)應(yīng)的給藥量灌胃7天，腹主動(dòng)脈采血，制備含藥血清。
　　4.取4周齡清潔級(jí)SD大鼠的膝

4、關(guān)節(jié)軟骨組織，經(jīng)Ⅱ型膠原酶消化后，用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，采用甲苯胺藍(lán)染色法和Ⅱ型膠原免疫組化法鑒定第三代的軟骨細(xì)胞，作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)用。
　　5.選取5個(gè)獨(dú)活寄生湯治療OA的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)為研究對(duì)象，以IL-1β誘導(dǎo)的退變軟骨細(xì)胞為模型，借助血清藥理學(xué)和蛋白印跡平臺(tái)，將第3代軟骨細(xì)胞分為空白對(duì)照組、模型組（IL-1β+生理鹽水血清）、治療組1（IL-1β+獨(dú)活寄生湯組血清）和治療組2(IL-1β+壯骨關(guān)節(jié)丸血清)

5、，觀察各組中預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的表達(dá)變化，以期進(jìn)一步闡明獨(dú)活寄生湯治療OA的靶點(diǎn)，并對(duì)其機(jī)制做初步探討。
　　結(jié)果：
　　1.構(gòu)建了含有566個(gè)化合物的獨(dú)活寄生湯化學(xué)成分分子數(shù)據(jù)庫(kù);以ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-11、MMP-13、 COX-2、IKK-β和5-LOX為靶點(diǎn)，以原配體打分值為閾值，從獨(dú)活寄生湯化學(xué)成分分子數(shù)據(jù)庫(kù)中分別篩出與其結(jié)合較好

6、的化合物0、1、172、103、28、2、91、113、33、16、14、127和117個(gè)，視為獨(dú)活寄生湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　2.化學(xué)空間特征研究結(jié)果顯示，獨(dú)活寄生湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)在分子量、氫鍵受體數(shù)目、氫鍵給體數(shù)目、脂水分配系數(shù)等描述符值的區(qū)間比已批準(zhǔn)OA治療藥物廣。而且，在化學(xué)空間上分布很分散，與藥物分子有較大的重疊。
　　3.網(wǎng)絡(luò)特征研究結(jié)果顯示，獨(dú)活寄生湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)對(duì)OA治療靶點(diǎn)的作用方式不是線性關(guān)系，即大部分化合

7、物只能作用于1個(gè)靶點(diǎn)，僅少數(shù)的化合物能作用于多個(gè)靶點(diǎn)，而且，具有混雜藥物性質(zhì)的化合物占70％。藥效物質(zhì)基礎(chǔ)-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)在路中心、最近距離中心、平均最短路徑長(zhǎng)度和拓?fù)湎禂?shù)統(tǒng)計(jì)上，具有較廣的分布。此外，靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)顯示預(yù)測(cè)的12個(gè)獨(dú)活寄生湯作用靶點(diǎn)與18類(lèi)疾病有關(guān)。
　　4.細(xì)胞鑒定結(jié)果顯示，細(xì)胞經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后呈異染性，Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽(yáng)性，由此說(shuō)明分離細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。
　　5.Western blot結(jié)果顯示，與

8、空白對(duì)照組相比，模型組的MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13和COX-2表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01)。與模型組相比，治療組1和治療組2的MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13和COX-2表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05)。與治療組2相比，治療組1的MMP-3、MMP-9、MMP-13和COX-2表達(dá)與治療組2無(wú)明顯差異（P＞0.05），但治療組1的MMP-1表達(dá)與治療組2有明顯差異(P＜0.01)。
　　結(jié)論：

9、r>　　1.獨(dú)活寄生湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)包含了264個(gè)化合物，能作用于12個(gè)OA治療靶點(diǎn)。
　　2.通過(guò)定量構(gòu)效關(guān)系和生物網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，直觀顯示了獨(dú)活寄生湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的化學(xué)空間和網(wǎng)絡(luò)特征，揭示了其主要是通過(guò)混雜藥物的方式起作用，能用于治療包括OA在內(nèi)的多種疾病。
　　3.獨(dú)活寄生湯能顯著抑制IL-1β誘導(dǎo)的退變軟骨細(xì)胞中MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13和COX-2表達(dá)，驗(yàn)證了分子對(duì)接預(yù)測(cè)獨(dú)活寄生湯治療OA的作用靶點(diǎn)