應(yīng)用Label-free技術(shù)研究人牙囊細胞和牙周膜成纖維細胞蛋白質(zhì)組.pdf

1、牙囊細胞（Human dental follicle cells，hDFCs）是形成以牙周膜為主體的牙周組織的前體細胞,牙周膜成纖維細胞（Human periodontal ligament fibroblasts，hPDLFs）是 hDFCs的重要子代細胞，參與牙周膜內(nèi)膠原纖維等細胞外基質(zhì)代謝。由于牙周炎較高的發(fā)病率及其造成的牙齒缺失，以建立牙周附著為中心的牙周組織再生一直被眾多學(xué)者關(guān)注。而牙周組織中，hDFCs和hPDLFs是具有組

2、織同源性和生物延續(xù)性、處于分化不同階段的細胞。hP DLF s繼承了hDFCs的很多特性，如形態(tài)上二者都具有成纖維細胞樣形態(tài)，生物學(xué)上都具有的異質(zhì)性，功能上都具有纖維形成和改建能力。近年對hDFCs向 hPDLFs轉(zhuǎn)化的研究也集中在細胞分化及再生有附著性的牙周膜上，這些研究多關(guān)注個別基因、蛋白質(zhì)、細胞因子、信號通路對hDFCs體內(nèi)、體外成骨、成纖維能力的影響，也有使用高通量方法研究分化前后兩種細胞基因水平的差異，但是對hDFCs轉(zhuǎn)化為

3、hPDLFs后的總體細胞代謝、蛋白表達變化并不關(guān)注。而在后基因時代，蛋白質(zhì)表達譜更能體現(xiàn)牙囊和牙周膜功能狀態(tài)的異同性。從蛋白水平探究細胞在分化前后的差別，有助于發(fā)現(xiàn)細胞分化前后哪些蛋白質(zhì)發(fā)生了顯著改變，為研究hDFCs成纖維分化機制提供蛋白質(zhì)水平參考。
　　本研究擬使用Label free蛋白定量技術(shù)研究hDFCs和hPDLFs蛋白表達譜及差異表達蛋白質(zhì)，為尋找hDFCs向 hPDLFs轉(zhuǎn)化的重要蛋白質(zhì)及臨床探索再生纖維性牙周附著

4、技術(shù)提供參考。
　　目的：
　　1.分離培養(yǎng)hDFCs和hPDLFs及蛋白質(zhì)樣品準備
　　2.獲得hDFCs和hPDLFs細胞全蛋白表達譜，進行相似性分析
　　3.尋找hDFCs和hPDLFs差異蛋白質(zhì)分析，差異蛋白質(zhì)qPCR驗證及細胞代謝差異分析
　　材料和方法：
　　1.分離培養(yǎng)、鑒定hDFCs和hPDLFs，應(yīng)用SDS-PAGE電泳對hDFCs和hPDLFs細胞總蛋白質(zhì)進行蛋白豐度初步分析。

5、r>　　2.利用LTQ orbitrapVelos液質(zhì)聯(lián)用儀配備戴安ultramate3000 nano-UPLC操作系統(tǒng)對預(yù)處理蛋白樣品 hDFCs1、hDFCs2、hPDLFs1、hPDLFs2中肽段行質(zhì)譜分析，結(jié)合定性定量軟件maxquant(1.5.0.12)，參考IPI人蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)V3.87獲得hDFCs和hPDLFs的蛋白質(zhì)原始數(shù)據(jù)。相同樣本進行生物學(xué)重復(fù)性、關(guān)聯(lián)性分析。對 hDFCs和hPDLFs總蛋白質(zhì)行蛋白比例、蛋白相

6、對含量及基因本體（Gene ontology，GO）分析。
　　3.結(jié)合蛋白質(zhì)鑒定原始數(shù)據(jù)，對hDFCs和hPDLFs蛋白譜行差異表達分析，并所得差異蛋白質(zhì)行GO分析、KEGG分析及qPCR驗證。
　　結(jié)果：
　　1.免疫熒光顯示hDFCs和hPDLFs細胞角蛋白陰性表達，波形絲蛋白陽性表達，具有成纖維細胞的生物學(xué)特性。SDS-PAGE證明 hDFCs和hPDLFs細胞總蛋白質(zhì)中均無極高豐度蛋白質(zhì)。
　　2.液相

7、色譜質(zhì)譜分析hDFCs1、hDFCs2、hPDLFs1、hPDLFs2四樣本共獲得906
　　個蛋白質(zhì)組，相同樣本間具有較高的重復(fù)性和關(guān)聯(lián)性。蛋白比列分析、蛋白相對含量分析及GO分析均顯示hDFCs和hPDLFs蛋白質(zhì)表達譜具有較高的相似性。
　　3. hDFCs和hPDLFs差異表達蛋白質(zhì)有22個（P<0.5，F(xiàn)C>2），其中上調(diào)蛋白質(zhì)7個（DRAP1、ECI1、EIF3G、HSP90B1、NIT1、PPP1CB、STX7

8、），下調(diào)蛋白質(zhì)15個（AKR1A1、ALCAM、CDC42、C TGF、CYR61、DDX1、DDX17;DDX5、DDX39A、F2、FKBP4、FST、GDI1;GDI2、MAT2A、RPL18A、TOMM6）。對特定差異蛋白行qPCR驗證，顯示hDFCs和hPDLFs中FST、CTGF、STX7、NIT1的表達變化與質(zhì)譜結(jié)果一致，但C TGF的組間差別無統(tǒng)計學(xué)意義。此外，GO分析顯示hDFCs向成纖維細胞分化后伴隨著細胞蛋白質(zhì)合成

9、、分泌功能加強。
　　結(jié)論：
　　hDFCs和hP DLF s細胞形態(tài)學(xué)的相似性、生物學(xué)功能上的延續(xù)性集中表現(xiàn)在蛋白質(zhì)表達譜的相似性上。但是由于兩種細胞處于牙周組織分化不同階段及分化前后細胞微環(huán)境的差異性持續(xù)存在，定量分析證實22個蛋白質(zhì)有明顯的表達差異。本實驗獲得的差異蛋白質(zhì)可能是 hDFCs較 hPDLFs具有更高增殖分化能力、hPDLFs較hDFCs具有更高膠原代謝能力的分子表現(xiàn)。這些差異蛋白質(zhì)為進一步研究hDFCs向