游離SiO2粉塵致肺成纖維細(xì)胞激活前后差異蛋白質(zhì)篩選.pdf

1、矽肺是塵肺病中發(fā)病快、病情嚴(yán)重、預(yù)后較差的一種,也是我國目前患病人數(shù)最多、危害性最大的一種職業(yè)病。矽肺的發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚,矽肺的基本病理變化是以形成矽結(jié)節(jié)為主和有一定間質(zhì)性纖維增生。在纖維化的發(fā)展過程中,肺成纖維細(xì)胞是一種重要的效應(yīng)細(xì)胞。肺成纖維細(xì)胞被激活,轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞是纖維化過程中的一種重要改變。肺成纖維細(xì)胞激活前后,蛋白質(zhì)分泌及合成發(fā)生相應(yīng)的改變,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)研究的有力手段。
　　 目的
　

2、　 利用雙向凝膠電泳技術(shù)分離激活和未激活的肺成纖維細(xì)胞表達(dá)的差異蛋白質(zhì),并對差異蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定,為探討矽肺生物標(biāo)志提供相關(guān)依據(jù)和基礎(chǔ)資料。
　　 方法：
　　 1.實驗組和對照組分別使用經(jīng)SiO2刺激和未經(jīng)SiO2刺激的大鼠肺巨噬細(xì)胞上清液,刺激大鼠肺成纖維細(xì)胞,分別得到激活和未激活的肺成纖維細(xì)胞。
　　 2.應(yīng)用固相IPG梯度膠條,進(jìn)行雙向凝膠電泳,分離激活前后的肺成纖維細(xì)胞的血清總蛋白,凝膠經(jīng)銀染顯色后,用

3、Amersham掃描儀獲得凝膠圖像。經(jīng)ImageMaster2D Platinum6.0專用凝膠圖像分析軟件進(jìn)行分析后,找出有差異的蛋白點。
　　 3.從凝膠上挖下部分差異表達(dá)的蛋白點,使用胰蛋白酶進(jìn)行膠內(nèi)原位酶切,經(jīng)MALDI-TOF-MS儀分析獲得的肽質(zhì)量指紋圖,然后利用Mascot查詢軟件搜尋數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)獲得了較好的雙向電泳銀染圖譜。經(jīng)圖像分析檢測發(fā)現(xiàn)2塊膠斑點匹配率達(dá)75

4、％。
　　 (2)實驗組和對照組的雙向電泳圖譜經(jīng)ImageMaster2D Platinum6.0軟件匹配分析,共篩選出13個差異的蛋白點,其中編號為1-4的蛋白點只在激活的肺成纖維細(xì)胞中表達(dá)；編號為5-7的蛋白點只在未激活的肺成纖維細(xì)胞中表達(dá)；編號為8-11的蛋白點在激活的肺成纖維細(xì)胞中高表達(dá)；編號為12、13的蛋白點在未激活的肺成纖維細(xì)胞中高表達(dá)。
　　 (3)從13個差異蛋白點中選出7個蛋白點,經(jīng)膠內(nèi)原位酶切-質(zhì)譜

5、指紋圖譜分析,獲得了6張肽質(zhì)量指紋圖譜,經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢分析,成功鑒定出6個蛋白質(zhì)分別為:不均一核糖核蛋白A2(heterogeneous nuclear ribonucleoprotelnA2)、膠轉(zhuǎn)蛋白2(transgelin2)僅在激活后表達(dá),3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde3-phosphate-dehydrogenase)、波形蛋白,CRA-b亞型(vimentin,isoform CPA-b)、過氧化還原酶5(