骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、實驗背景：
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow Stem Cells,BMSCs）作為目前較理想的組織工程瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的種子細(xì)胞，相對于其他來源的種子細(xì)胞具有獲取方便、很強的自我更新、多向分化潛能，以及獨特的免疫特性等優(yōu)點。正常心臟瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中的成纖維細(xì)胞對于維持正常心臟瓣膜的結(jié)構(gòu)和功能具有更重要的意義。目前應(yīng)用hBMSCs構(gòu)建的組織工程心臟瓣膜多需移植入動物體內(nèi)后一段時間才能完成組織工程瓣膜的成纖維細(xì)胞表型和基質(zhì)的最

2、后重塑，尚不清楚hBMSCs向成纖維細(xì)胞進行分化的具體機制以及其功能特點。
　　BMSCs和成纖維細(xì)胞具有非常相似細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表型特點及細(xì)胞表面分子。通過基因組學(xué)的方法研究發(fā)現(xiàn)在兩種細(xì)胞中確實存在一些差異基因。蛋白質(zhì)組，作為細(xì)胞基因組的最后表達(dá)，能夠更詳盡、更直接地描述細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能特點。
　　目的：
　　采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法全面比較hBMSCs和成纖維細(xì)胞中蛋白表達(dá)的差異，進一步在蛋白水平理解兩種在細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能

3、差異。
　　方法：
　　1．自正常人髂骨抽取骨髓，綜合采用密度梯度離心和貼壁篩選的方法，分離、純化出hBMSCs，在低糖DMEM/F12培養(yǎng)、擴增；倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長，流式細(xì)胞儀檢測表面抗原CD29、CD34和CD45，并對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進行成骨、成脂多向分化誘導(dǎo)，進行細(xì)胞性質(zhì)鑒定。成纖維細(xì)胞是人成纖維細(xì)胞系細(xì)胞（購自Cell Applications公司）。
　　2．對兩種細(xì)胞的蛋白樣本進行雙向凝膠電泳分離，通

4、過銀染顯色，獲取兩種細(xì)胞的蛋白組學(xué)圖譜，通過比較兩種細(xì)胞的圖譜，挖取差異表達(dá)的蛋白點進行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜肽質(zhì)量指紋圖分析和蛋白數(shù)據(jù)庫信息檢索。選取蛋白進行Western Blot和免疫組織化學(xué)實驗驗證蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　1．原代細(xì)胞呈貼壁,集落樣生長；細(xì)胞傳代后，呈梭形,少數(shù)細(xì)胞呈多角形，魚群或放射狀排列。hBMSCs的表面抗原CD29陽性而造血干細(xì)胞具有的表面抗原CD34和CD45為陰性

5、；成骨和成脂誘導(dǎo)后，分別行Von kossa染色和油紅-O染色結(jié)果呈陽性。實驗從正反兩方面論證、確認(rèn)了所分離培養(yǎng)的細(xì)胞即為hBMSCs。
　　2．hBMSCs和成纖維細(xì)胞全蛋白提取后,進行雙向凝膠電泳分析,共進行3次實驗得到銀染結(jié)果，兩種細(xì)胞的電泳圖譜蛋白斑點分布模式具有一定的相似性。3次重復(fù)性實驗結(jié)果經(jīng)Imaging Master 2D Elite 510軟件分析,發(fā)現(xiàn)hBMSCs可以檢測到782±65個點,成纖維細(xì)胞可以檢測到

6、760±57個點,這些蛋白質(zhì)等電點和相對分子質(zhì)量分布范圍較廣,但大多數(shù)集中于pH4～8,相對分子質(zhì)量15～100ku區(qū)域。對其中穩(wěn)定表達(dá)的差異蛋白質(zhì)斑點進行切割,用胰蛋白酶消化后進行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜分析，通過UniProtKB/Swiss-PROT和NCBI nonredundant protein databases蛋白數(shù)據(jù)庫搜索，成功地鑒定出29種表達(dá)蛋白，其中有17種蛋白在兩種細(xì)胞中有顯著差別地表達(dá)，另外12種蛋白