應(yīng)用抑制消減雜交技術(shù)(SSH)篩選癲癇的相關(guān)基因.pdf

1、目的:
　　 癲癇(epilepsy)是以腦神經(jīng)元異常放電引起的慢性反復(fù)發(fā)作性短暫腦功能失調(diào)綜合征，是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病之一。顳葉癲癇（TemporalLobeEpilepsy，TLE）占難治性癲癇(refractoryepilepsy，RE)患者的60％～70％，是局限性癲癇的代表，主要病理表現(xiàn)為海馬、杏仁核、嗅皮層及正中丘腦核團(tuán)內(nèi)選擇性神經(jīng)元脫失、膠質(zhì)細(xì)胞增生、苔蘚纖維出芽以及特異性突觸重塑。
　　 近年來應(yīng)用原位雜交

2、法、免疫組化法及cDNA微陣列等方法研究發(fā)現(xiàn)了一些與癲癇相關(guān)的異?；虮磉_(dá)，這些基因參與免疫應(yīng)答、炎癥、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子及細(xì)胞周期調(diào)控。盡管傳統(tǒng)雜交方法在某些研究中成功運用，但是不適合鑒別稀有基因。與傳統(tǒng)雜交方法不同，抑制消減雜交技術(shù)(suppressionsubtractivehybridization，SSH)是一種功能強(qiáng)大的鑒別稀有信息的方法，并且擁有快速、靈敏、高效、假陽性率低和可重復(fù)性的特點。
　　 本實驗

3、應(yīng)用SSH技術(shù)對氯化鋰—匹魯卡品致癇大鼠這一公認(rèn)的顳葉癲癇大鼠模型的海馬組織構(gòu)建差異表達(dá)基因的正向消減cDNA文庫，尋找與癲癇發(fā)作有關(guān)的新的基因片段，以進(jìn)一步探索顳葉癲癇的發(fā)病機(jī)制和相關(guān)基因的特征。
　　 方法:
　　 1.建立顳葉癲癇大鼠模型，成年健康雄性Wistar大鼠14只，體質(zhì)量200～250g，山東大學(xué)實驗動物中心提供。分為癲癇組8只，對照組6只。癲癇組給予氯化鋰127mg/kg腹腔注射，24h后腹腔注射匹魯卡

4、品30mg/kg，在匹魯卡品注射前30min給予阿托品1mg/kg腹腔注射，以拮抗外周膽堿能效應(yīng)。出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)90min后給予安定10mg/kg腹腔注射終止發(fā)作。對照組給予相同劑量的生理鹽水腹腔注射。
　　 2.提取組織RNA并用于SSH分離差異表達(dá)基因的cDNA片段，將其與T載體進(jìn)行T/A連接構(gòu)建文庫，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行文庫擴(kuò)增后，隨機(jī)挑取個60個白色克隆用菌落PCR法篩選差異基因克隆，并進(jìn)行測序分析。
　　

5、 3.測序結(jié)果通過BLAST序列對比工具進(jìn)行同源性比較，并應(yīng)用GeneOntology(GO)對基因進(jìn)行功能性分類。
　　 結(jié)果:
　　 1.顳葉癲癇大鼠模型:匹魯卡品致癇后按照Racine大鼠癲癇發(fā)作分級標(biāo)準(zhǔn)判定其發(fā)作程度，發(fā)作達(dá)到3～5級的大鼠視為誘導(dǎo)成功，表現(xiàn)為點頭、面部肌肉抽搐、肢體陣攣和跌倒等。癲癇組有兩只死亡，在實驗組中剔除。對照組無死亡。
　　 2.對鑒定出的基因進(jìn)行功能分類，發(fā)現(xiàn)這些基因與細(xì)胞生