應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)研究胃癌差異表達(dá)基因.pdf

1、【目的】胃癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤.在惡性腫瘤死亡率中占第二位.人體中每個(gè)細(xì)胞均具有相同的一套基因組.但何種基因表達(dá)及其表達(dá)量決定了細(xì)胞的命運(yùn).正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化后基因表達(dá)也隨之改變.因此分離和鑒別胃癌的差異表達(dá)基因是非常必要的.研究基因表達(dá)差異的方法很多,該研究的目的是應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)鑒定胃癌與正常胃組織之間的差異表達(dá)基因.【方法】標(biāo)本來(lái)自胃竇部低分化腺癌的病人,術(shù)中分別取腫瘤組織和遠(yuǎn)切端正常組織,立即投放入液氮中備用.兩標(biāo)本都經(jīng)過(guò)

2、病理證實(shí).采用TRIZOL試劑提取腫瘤和正常組織的RNA,然后用QIAGEN公司的Oligotex mRNA Purification Kit抽提mRNA.采用Clontech公司的PCR-Select cDNA Subtraction Kits進(jìn)行抑制性消減雜交.在正向消減中,正常胃組織作為tester胃癌組織作為driver,而在反向消減中,正常胃組織作為driver而胃癌組織作為tester.二級(jí)PCR產(chǎn)物連接入QIAGEN公司P

3、CR Cloning plus Kit的pDrive Cloning Vector然后轉(zhuǎn)化EZ Competent Cells.菌液在表面覆蓋X-Gal/IPTG的氨芐青LB平板上鋪板.培養(yǎng)過(guò)夜后在正常胃組織的消減文庫(kù)中獲得105個(gè)克隆,在胃癌組織的消減文庫(kù)中獲得53個(gè)克隆.挑出所有克隆在3-5ml含100μg/ml的氨芐青的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜.抽提純化所有消減克隆的質(zhì)粒DNA,然后用BamH1和Xbal酶切.通過(guò)電泳,在2％的瓊脂糖

4、EB膠中區(qū)分不同大小的消減cDNA片段.用含不同cDNA片段的消減克隆進(jìn)行測(cè)序.用BLAST程序進(jìn)行核酸同源性分析.RT-PCR驗(yàn)證SSH結(jié)果.從腫瘤組織的SSH文庫(kù)中挑選TGFBI和FSTL1,應(yīng)用半定量RT-PCR的方法研究它們?cè)?2例胃癌病人的腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)情況.【結(jié)論】綜上所述,我們認(rèn)為SSH是一種能夠快速的從基因表達(dá)譜中鑒別差異表達(dá)基因的方法.通過(guò)這種方法,我們?cè)谡Ｎ附M織的消減文庫(kù)中獲得7個(gè)差異表達(dá)基因,在胃癌組