利用抑制差減雜交(SSH)技術(shù)研究脂多糖誘導(dǎo)的點帶石斑魚功能基因.pdf

1、本研究首先以熱酚水抽提法提取致病溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)強毒株HN08155和弱毒株HN08152的粗脂多糖(Lipopolysaccharidcs，LPS)；以弱毒株HN08152和大腸桿菌(Escherichia coli)LPS作對照，將不同濃度的溶藻弧菌強毒株HN08155粗LPS通過腹腔注射法接種點帶石斑魚(Epinephelus malabaricus)，通過測定死亡率和各組石斑魚血液中白細(xì)胞吞噬

2、活性、血清抗菌活性、溶菌活性和酚氧化酶活性等免疫指標(biāo)，研究該LPS對點帶石斑魚的毒性和免疫保護(hù)力。結(jié)果表明，溶藻弧菌強毒株和弱毒株粗LPS均對石斑魚具有比較強的毒性，溶藻弧菌LPS對石斑魚的免疫保護(hù)力隨LPS濃度的增高而增強，高純度的大腸桿菌LPS對石斑魚的免疫保護(hù)效果要優(yōu)于溶藻弧菌粗LPS。
　　 選用低濃度、高純度大腸桿菌LPS刺激的石斑魚頭腎細(xì)胞cDNA為Tester組，注射PBS的對照組石斑魚頭腎細(xì)胞cDNA為Drive

3、r組，進(jìn)行抑制差減雜交(SuppressionSubtraetive Hybridization，SSH)，構(gòu)建cDNA文庫。對陽性克隆進(jìn)行測序并經(jīng)生物信息學(xué)分析，共獲得13種不同功能基因的克隆。其中免疫相關(guān)功能基因干擾素調(diào)節(jié)因子-2(irf2)、T-Complex protein 1-theta(tcp-1-theta)、40S核糖體蛋白S8(rpS8)和空泡蛋白分選(vps8)基因共4種；氧運輸功能基因血紅素-α鏈(alpha-ch

4、ain Hb)、血紅素-β鏈(beta-chain Hb)和鐵蛋白重鏈(fhc)3種；轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)節(jié)功能基因有蛋白質(zhì)翻譯延伸延伸因子-2(Eef2)和膠原蛋白C的內(nèi)肽酶增強子(pcpe)2種；代謝功能基因ct054 1種；其他功能基因有骨髓白細(xì)胞分化蛋白家族(Myeloid leukemia differentiation proteinhomologue)基因、斑馬魚基因庫中編號為73290基因(zgc：73290)和未命名蛋白基因3