miR-21及其靶基因Sprouty1調(diào)控人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的機制研究.pdf

1、在炎癥性骨疾病中，骨形成能力受損是造成骨丟失的主要原因之一。提高骨形成能力是治療這類疾病的關(guān)鍵問題。骨髓間充質(zhì)干細胞（BMMSCs）是成骨細胞和骨細胞的前體細胞。在炎癥性骨疾病如骨質(zhì)疏松，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，BMMSCs分化為成骨細胞的能力減弱可能導(dǎo)致骨形成障礙。因此，研究調(diào)控BMMSCs的成骨分化機制，提高骨髓間充質(zhì)成骨分化能力對于治療炎癥性骨疾病具有重要意義。
　　MicroRNAs(miRNA)是一類短小的非編碼RNA，它們通

2、過翻譯后抑制或者降解靶基因的mRNA在細胞的多種生理病理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，例如細胞的增殖、分化、凋亡和癌癥的發(fā)生進展。研究表明，miRNAs能夠調(diào)控間充質(zhì)干細胞和成骨細胞的成骨分化。本課題組前期結(jié)果和文獻報道均表明，miR-21與人骨髓間充質(zhì)干細胞(hBMMSCs)成骨分化以及絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松相關(guān)，但miR-21是否調(diào)控了hBMMSCs的成骨分化，以及miR-21如何調(diào)控hBMMSCs的成骨分化，它們的表達和功能是否在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏

3、松環(huán)境中發(fā)生變化，目前還未知曉。研究miR-21對hBMMSCs成骨分化的調(diào)控作用以及在骨質(zhì)疏松環(huán)境下表達和功能的異常，對于理解BMMSCs成骨分化的機制和開發(fā)治療骨質(zhì)疏松新的治療策略具有重要意義。
　　研究目的
　　1.探討miR-21在hBMMSCs成骨分化過程中的表達。
　　2.探討miR-21在hBMMSCs體外與體內(nèi)成骨分化過程中的調(diào)控作用。
　　3.探討miR-21調(diào)控hBMMSCs成骨分化的分子機制

4、。
　　4.探討miR-21在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松骨髓間充質(zhì)干細胞（PMOP-hBMMSC）中表達和功能的異常。
　　研究方法
　　1.利用密度梯度離心和全骨髓貼壁相結(jié)合的方法分離培養(yǎng)hBMMSCs，流式細胞技術(shù)檢測表面分子表達；克隆集落形成、MTT、細胞周期分析檢測細胞增殖能力。成骨、成脂、成神經(jīng)誘導(dǎo)檢測hBMMSCs多向分化能力。RealtimeRT-PCR分析成骨成脂誘導(dǎo)后標(biāo)志性基因的表達。
　　2.利用Real

5、timeRT-PCR檢測miR-21在hBMMSCs成骨分化中的表達變化。通過轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達或者抑制miR-21的表達，體外檢測hBMMSCs成骨分化能力。ALP、茜素紅染色觀察堿性磷酸酶和鈣化結(jié)節(jié)的表達。RealtimeRT-PCR和WesternBlot檢測成骨標(biāo)志性基因Runx2和Osterix的表達，并且將miR-21不同表達水平的hBMMSCs植入裸鼠皮下，8周后取材，固定后脫鈣兩周石蠟包埋切片，HE染色和Masson三色染色

6、觀測體內(nèi)類骨質(zhì)形成。
　　3.生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)合熒光素酶報告檢測和WesternBlot蛋白分析，確定miR-21在hBMMSCs成骨分化中作用的主要靶基因Sprouty1(Spry1)。WesternBlot檢測Spry1在成骨過程的表達。構(gòu)建Spry1慢病毒表達載體，感染hBMMSCs。ALP、茜素紅染色、RT-PCR和WesternBlot分析Spry1高表達后，hBMMSCs成骨能力的改變。
　　4.分離培養(yǎng)正常人（

7、H-hBMMSCs）和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者(PMOP-hBMMSCs)的骨髓間充質(zhì)干細胞，并對兩組細胞的成骨能力進行比較。RealtimeRT-PCR比較miR-21在兩組細胞間的表達差異，同時檢測兩組hBMMSCs中Spry1基因和蛋白水平表達的差異。利用轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)PMOP-hBMMSCs中miR-21的水平，檢測其成骨能力的改變及Spry1的表達變化。
　　實驗結(jié)果
　　1.分離培養(yǎng)的hBMMSCs表達間充質(zhì)表面標(biāo)志物

8、，而不表達造血系標(biāo)志物?？寺〖浜蚆TT結(jié)果顯示hBMMSCs具有自我更新和復(fù)制的能力。成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化，證明培養(yǎng)的hBMMSCs具有多向分化能力。
　　2.miR-21在hBMMSCs成骨過程中表達量升高。通過對miR-21的功能分析發(fā)現(xiàn)，高表達miR-21能夠促進hBMMSCs體外成骨分化，并且也能夠促進hBMMSCs體內(nèi)異位成骨能力，而沉默miR-21能夠抑制hBMMSCs體外成骨分化，降低hBMMSCs體內(nèi)異位成

9、骨能力。
　　3.通過生物信息學(xué)預(yù)測的方法篩選出了miR-21的靶基因Spry1。熒光素酶報告檢測和蛋白分析證明Spry1是miR-21的靶基因。通過對Spry1在成骨過程中表達譜分析發(fā)現(xiàn)Spry1在成骨過程中表達量下降而與miR-21在成骨分化中的表達相反。Spry1功能分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)Spry1能夠抑制hBMMSCs的成骨分化。
　　4.與H-hBMMSCs相比PMOP-hBMMSCs成骨能力明顯減弱，而且miR-21表達

10、下降，Spry1表達上升。通過轉(zhuǎn)染miR-21，能夠部分恢復(fù)PMOP-hBMMSCs的成骨分化能力，下調(diào)Spry1。
　　結(jié)論：
　　1.miR-21能夠促進hBMMSCs的體外成骨分化能力。
　　2.miR-21能夠增強hBMMSCs體內(nèi)異位成骨的能力。
　　3.miR-21通過抑制其靶基因Spry1的表達來促進hBMMSCs的成骨分化。
　　4.PMOP-hBMMSCs成骨能力減弱，miR-21-Spr