miR-125b通過靶向抑制Smad4表達調控骨髓間充質干細胞成骨分化.pdf

1、目的：探討 miR-125b是否通過靶向調控 Smad4表達調控骨髓間充質干細胞（MSCs）成骨分化，揭示了miR-125b調控MSCs成骨分化過程的分子機制。
　　方法：利用密度梯度離心法分離培養(yǎng)骨髓MSCs，并通過流式細胞技術鑒定MSCs表面分子標志物，并誘導其向成骨分化，通過檢測堿性磷酸酶（ALP）活性及成骨關鍵基因RUNX2、Osterix表達檢測MSCs成骨分化能力；將miR-125b mimics或 inhibitor

2、s轉染 MSCs細胞并進行成骨誘導，檢測過表達或干擾 miR-125b對MSCs成骨分化的影響；構建Smad43'UTR-熒光素酶報告載體，與miR-125b共轉染COS7細胞，通過熒光素酶報告觀察miR-125b是否能與Smad43'UTR-特異性結合；將miR-125b mimics轉染MSCs細胞并進行成骨誘導，采用qRT-PCR、Western blot檢測Smad4表達水平；在MSCs細胞中轉染Smad4 siRNA并進行成骨

3、誘導，考察沉默Smad4表達是否影響MSCs成骨分化能力。
　　結果：分離培養(yǎng)的骨髓MSCs表達CD44、CD29，不表達CD34和CD45，符合人骨髓間充質干細胞的特征。骨髓 MSCs在成骨誘導培養(yǎng)下后，ALP活性明顯升高，RUNX2和Osterix表達，說明MSCs具有成骨分化能力。過表達miR-125b抑制骨髓MSCs成骨分化，反之miR-125b則促進骨髓MSCs成骨分化。干擾雙熒光素報告檢測顯示，miR-125b能特異性

4、地與Smad4 mRNA的3’UTR結合。qRT-PCR、Western blot檢測結果顯示，在MSCs成骨分化過程中上調miR-125b表達能顯著抑制Smad4表達。而沉默Smad4表達AKP活性及RUNX2、Osterix表達水平明顯下降，并且能部分模擬miR-125b調控 MSCs成骨分化的功能。
　　結論:
　　(1) miR-125b通過抑制靶基因Smad4的表達調控骨髓間充質干細胞成骨分化。
　　(2)利