視黃醇結(jié)合蛋白4促高胰島素血癥血管平滑肌增殖作用及機(jī)制的研究.pdf

1、第一章，冠心病合并高胰島素血癥患者血漿視黃醇結(jié)合蛋白4水平變化
　　目的:冠心病(coronary heart disease，CHD)是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂伴隨血小板聚集、血栓形成，冠脈血管發(fā)生不同程度的狹窄乃至完全閉塞，從而導(dǎo)致不同程度的心肌缺血的一組臨床綜合征。胰島素抵抗(insulin resistance，IR)目前已被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)和心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。胰島素水平

2、不僅與冠心病的患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，而且與冠心病的預(yù)后及冠狀動(dòng)脈的病變程度有關(guān)。視黃醇結(jié)合蛋白4(Retinol binding protein，RBP4)作為新發(fā)現(xiàn)的參與胰島素抵抗的脂肪細(xì)胞因子，已被發(fā)現(xiàn)與肥胖、胰島素抵抗、冠心病、代謝綜合征等存在著密不可分的關(guān)聯(lián)。但冠心病以及冠心病合并胰島素異常的患者RBP4水平如何尚未見(jiàn)報(bào)道。本章測(cè)定冠心病患者以及冠心病合并高胰島素血癥患者血漿RBP4的水平，分析RBP4與血糖及血脂代謝，與胰島素抵抗的相

3、關(guān)性，探討冠心病與RBP4的關(guān)系以及高胰島素血癥對(duì)冠心病患者血漿RBP4的影響。
　　方法:收集2009年9月-2010年5月在我院經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影（coronary angiography, CAG）檢查證實(shí)為冠心病患者30例(CAD組)，冠心病合并高胰島素患者29例（CAD+HIns組）;另設(shè)正常對(duì)照30例（對(duì)照組）。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血漿RBP4水平;同時(shí)測(cè)患者身高、質(zhì)量，計(jì)算質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BM

4、I)，測(cè)腰圍、臀圍，計(jì)算腰/臀(waist-to-hip ratio，WHR)，測(cè)收縮壓與舒張壓;AXSYM全自動(dòng)標(biāo)記免疫化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)空腹血糖(Fasting PlasmaGlucose，F(xiàn)PG)、空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)Ins)、餐后2h胰島素(2-hour postprandial inslulin，2hPIns)，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment-insulin

5、resistance index, HOMA-IR),全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血脂水平以及高敏C反應(yīng)蛋白（High Sensitivity C Reactive Protein，hs-CRP)、尿酸(Uric Acid，UA)、游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)等生化指標(biāo)。
　　結(jié)果:
　　1、一般臨床資料比較:三組間年齡、收縮壓、舒張壓以及腰/臀比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。CAD+HIns組的BMI顯著

6、高于CAD組和對(duì)照組(P＜0.01)。
　　2、臨床生化資料比較:CAD+HIns組的FIns、2hPIns、HOMA-IR、UA均顯著高于其他兩組(P＜0.01)。 CAD+HIns組和CAD組的TG、hs-CRP均顯著高于對(duì)照組，HDL-C顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。CAD組LDL-C顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。各組間FPG、TC、FFA差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、血漿RBP4的比較:CAD+HIns組顯著高于C

7、AD組和對(duì)照組(P＜0.01)，CAD組和正常對(duì)照組間無(wú)顯著性差異。
　　4、血漿RBP4與BMI、TG、UA、hsCRP、FPG、FIns、2hPIns、HOMA-IR呈顯著正相關(guān)(相關(guān)指數(shù)分別為r=0.259，P＜0.05;r=0.236、r=0.243、r=0.231、r=0.331、r=0.582、r=0.452、r=0.600, P＜0.01),與HDL-C呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.290，P＜0.01)。BMI、2hPI

8、ns、HOMA-IR是RBP4的獨(dú)立相關(guān)因素(決定系數(shù)分別為r2=0.181，P＜0.05; r2=0.273、r2=0.516，P＜0.01)。
　　結(jié)論:合并高胰島素血癥的冠心病患者血漿RBP4水平顯著升高，且血漿RBP4與BMI、血脂、尿酸等心血管危險(xiǎn)因素正相關(guān)，BMI、2hPIns、HOMA-IR是RBP4的獨(dú)立相關(guān)因素。
　　第二章，視黃醇結(jié)合蛋白4與高胰島素血癥大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌增殖的關(guān)系
　　目的:本文

9、第一章研究發(fā)現(xiàn)合并高胰島素血癥的冠心病患者血漿RBP4與BMI、TG呈顯著正相關(guān)(相關(guān)指數(shù)分別為r=0.259，P＜0.05;r=0.236，P＜0.01)，與HDL-C呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.290，P＜0.01)。亦發(fā)現(xiàn)RBP4與炎癥因子hsCRP呈顯著正相關(guān)(r=0.231，P＜0.01)。在胰島素抵抗(IR)致動(dòng)脈粥樣硬化(AS)與冠心病的發(fā)病機(jī)理中，RBP4與血脂及炎癥因子的密切相關(guān)提示RBP4可能在AS的發(fā)生和發(fā)展中起促進(jìn)作

10、用。那么RBP4與AS的病理基礎(chǔ)——血管平滑肌增殖的關(guān)聯(lián)有待進(jìn)一步研究。
　　胰島素抵抗時(shí)，若胰島β細(xì)胞功能良好，導(dǎo)致機(jī)體代償性出現(xiàn)高胰島素血癥，高胰島素血癥通過(guò)Shc/Raf/MAPK途徑可加強(qiáng)胰島素促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖、增加膠原合成，促進(jìn)生長(zhǎng)因子合成的作用，表現(xiàn)為高胰島素血癥致動(dòng)脈粥樣硬化的效應(yīng)加強(qiáng);本章研究希望在高胰島素血癥SD大鼠模型上明確RBP4與血管平滑肌增殖是否相關(guān)，以及RBP4與VSMC增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否有關(guān)聯(lián)

11、，為防治高胰島素促進(jìn)血管平滑肌增殖提供新的作用靶點(diǎn)。
　　方法:選取10周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為兩組:即對(duì)照組(Congroup)和高胰島素組(HIns group)，每組7只。其中高胰島素組參照文獻(xiàn)制作高胰島素血癥SD大鼠動(dòng)物模型。大鼠尾靜脈采血，羅氏血糖儀檢測(cè)空腹血糖(FPG)，Hitach75全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定總膽固醇(total cholesterol，TC)，甘油三酯（triglyceride，TG），高密度脂蛋白膽固

12、醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)，低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）及高敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP），采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血漿空腹胰島素(FIns)和RBP4濃度，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。SD大鼠麻醉后取胸主動(dòng)脈，行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色。

13、利用計(jì)算機(jī)輔助成像系統(tǒng)測(cè)算動(dòng)脈中層厚度(media thickness，MT)，管腔直徑（lumen diameter，LD）。提取胸主動(dòng)脈mRNA及蛋白，采用Real-Time PCR及Werstern-Blot方法測(cè)量大鼠胸主動(dòng)脈細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶ERK1/2、磷酸化ERK1/2(P-ERK1/2)mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、HIns組大鼠血漿空腹血糖、胰島素、HOMA-IR與甘油三酯(TG)均顯著高

14、于Con組大鼠(P＜0.05)，高胰島素血癥SD大鼠模型成功。
　　2、HIns組大鼠TG、hs-CRP顯著高于Con組，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）顯著低于Con組(P＜0.01)。膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3、HIns組大鼠RBP4顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)
　　4、HE染色顯示HIns組胸主動(dòng)脈平滑肌增殖明顯，HIns組大鼠主動(dòng)脈中層厚度(media th

15、ickness，MT)、主動(dòng)脈管腔直徑(lumendiameter，LD)較Con組大鼠略有增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　5、HIns組胸主動(dòng)脈P-ERK1/2 mRNA及蛋白表達(dá)明顯高于Con大鼠(P＜0.05)，ERK1/2 mRNA及蛋白表達(dá)兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)
　　6、血漿RBP4與MT、P-ERK1/2蛋白表達(dá)、P-ERK1/2mRNA表達(dá)呈顯著正相關(guān)。校正FIns值以后，血漿RBP4

16、與P-ERK1/2蛋白表達(dá)仍呈顯著正相關(guān)。
　　結(jié)論:高胰島素血癥SD大鼠血漿RBP4水平明顯增加，且循環(huán)RBP4水平與大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌增殖呈正相關(guān)，與平滑肌增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路EPK1/2的磷酸化程度呈顯著正相關(guān)，校正空腹胰島素后正相關(guān)仍然存在。
　　第三章，視黃醇結(jié)合蛋白4促高胰島素誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖作用及機(jī)制研究
　　目的:高胰島素血癥是心血管事件的重要危險(xiǎn)因素。本文第一章研究提示合并高胰島素的冠心病患者血漿R

17、BP4水平顯著升高，且血漿RBP4與BMI、血脂、尿酸等心血管危險(xiǎn)因素正相關(guān)，BMI、2hPIns、HOMA-IR是RBP4的獨(dú)立相關(guān)因素，提示RBP4在AS、CAD的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。本文第二章在高胰島素血癥模型大鼠血標(biāo)本的研究中再次驗(yàn)證血漿RBP4與胰島素抵抗指標(biāo)HOMA-IR及炎癥相關(guān)因子hsCRP呈顯著正相關(guān)，并且取大鼠主動(dòng)脈平滑肌進(jìn)行進(jìn)一步研究，首次發(fā)現(xiàn)循環(huán)RBP4水平與血管平滑肌血管壁厚度以及增殖信號(hào)—細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白

18、激酶ERK1/2磷酸化程度正相關(guān)，提示RBP4與血管平滑肌細(xì)胞增殖密切相關(guān)。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smoothmuscle cell，VSMC)的增殖對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的形成以及冠心病的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義。VSMC增殖和遷移與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，其中包括MAPK通路以及JAK/STAT通路。本章采用高胰島素刺激大鼠血管平滑肌細(xì)胞株(Rat vascular smooth muscle cell，RVSMC)，觀察RVS

19、MC細(xì)胞增殖情況，并首次在平滑肌細(xì)胞中采用RBP4作為干預(yù)因素，明確RBP4水平與VSMC增殖的因果關(guān)系，觀察其對(duì)RVSMC細(xì)胞增殖情況及增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，以進(jìn)一步明確RBP4對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制。
　　方法:培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞株，分別用不同濃度(0，10-9M，10-8M，10-7M，10-6M，10-5M，10-4M) Ins處理不同時(shí)間(3h，6h，12h，24h，48h)，采用MTT法及流式細(xì)胞

20、儀測(cè)定細(xì)胞周期法觀察大鼠血管平滑肌細(xì)胞的增殖情況;采用Werstern-Blot法檢測(cè)大鼠血管平滑肌細(xì)胞ERK1/2，P-ERK1/2（磷酸化ERK1/2），JAK2，P-JAK2（磷酸化JAK2），STAT3，P-STAT3（磷酸化STAT3）蛋白的表達(dá)。低濃度(1μg/ml)及高濃度(4μg/ml) RBP4預(yù)處理大鼠血管平滑肌細(xì)胞1h后給予Ins終濃度10-5M處理24h，采用MTT法及流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期法觀察大鼠血管平滑肌細(xì)

21、胞的增殖情況;采用Werstern-Blot法檢測(cè)大鼠血管平滑肌細(xì)胞ERK1/2，P-ERK1/2，JAK2，P-JAK2，STAT3，P-STAT3蛋白的表達(dá)。分別予以ERK1/2特異性抑制劑 PD980592及JAK特異性抑制劑AG490預(yù)處理細(xì)胞10min后給予Ins以終濃度105M以及RBP4以濃度4μg/ml處理24h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化。
　　結(jié)果:
　　1、 Ins可呈濃度

22、及時(shí)間依賴性的刺激大鼠血管平滑肌細(xì)胞的增殖，以10-5M Ins處理大鼠血管平滑肌細(xì)胞24h后最為顯著。
　　2、 RBP4預(yù)處理大鼠血管平滑肌細(xì)胞1h后，加入10-5M Ins繼續(xù)處理細(xì)胞24h，可見(jiàn)大鼠平滑肌細(xì)胞增殖能力顯著上升。
　　3、 Ins可呈濃度及時(shí)間依賴性的刺激大鼠血管平滑肌細(xì)胞ERK1/2，P-ERK1/2，JAK2，P-JAK2，STAT3，P-STAT3的表達(dá)，以10-5MIns處理大鼠血管平滑肌細(xì)胞2

23、4h后最為顯著。
　　4、 RBP4預(yù)處理大鼠血管平滑肌細(xì)胞1h后，加入10-5M Ins繼續(xù)處理細(xì)胞24h，可見(jiàn)RBP4可顯著增強(qiáng)Ins誘導(dǎo)的P-ERK、P-JAK2蛋白的表達(dá)，對(duì)P-Stat3的表達(dá)無(wú)明顯增強(qiáng)作用。
　　5、RBP4能顯著增加Ins促平滑肌細(xì)胞增殖的能力，預(yù)先以ERK1/2抑制劑PD98059處理10min可顯著抑制RBP4的該效應(yīng)，但JAK抑制劑AG490處理對(duì)Ins+RBP4誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖無(wú)明顯