血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)其前體基因表達(dá)及促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制研究.pdf

1、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth nluscle cells，VSMC)異常增殖是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成、高血壓和血管成形術(shù)后再狹窄等血管增殖性疾病共同的細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)。雖然多種細(xì)胞因子和血管活性物質(zhì)能促進(jìn)VSMC的增殖，但血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)在VSMC增殖及高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、血管再狹窄等血管重塑性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中處于關(guān)鍵地位。已經(jīng)證明，在心血管系統(tǒng)中，VSMC不僅是AngⅡ的一個(gè)重要來(lái)

2、源，而且也是AngⅡ調(diào)節(jié)血管功能的重要靶細(xì)胞。因此，研究AngⅡ調(diào)節(jié)其前體基因表達(dá)及促進(jìn)VSMC增殖的作用機(jī)制，對(duì)闡明血管增殖性疾病的分子機(jī)制具有重要意義。 細(xì)胞核內(nèi)的c-Jun水平即顯著升高并在此水平上保持至3 h。而且，免疫細(xì)胞化學(xué)染色證實(shí)，AngⅡ誘導(dǎo)表達(dá)的c-Jun主要分布在細(xì)胞核內(nèi)。用抗絲氨酸磷酸化抗體對(duì)核提取物進(jìn)行免疫沉淀后檢測(cè)磷酸化型c-Jun水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，伴隨著c-Jun表達(dá)增高，磷酸化型c-Jun水平也平行升高。

3、用CHX預(yù)處理VSMC 0.5 h后，再用AngⅡ刺激，c-Jun表達(dá)雖然不受影響，但其磷酸化水為了闡明AngⅡ調(diào)節(jié)血管緊張素原基因表達(dá)及促進(jìn)VSMC增殖的分子機(jī)制，本研究觀察AngⅡ?qū)D(zhuǎn)錄激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)表達(dá)活化及其對(duì)血管緊張素原基因表達(dá)的影響；探討AP-1與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子5(signal transducer and activator of transcription 5，S

4、TAT5)在調(diào)節(jié)血管緊張素原基因表達(dá)中的相互關(guān)系；確定AngⅡ誘導(dǎo)VSMC增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及roscovitine抗VSMC增殖的作用靶點(diǎn)。 1 AngⅡ調(diào)節(jié)其前體基因在VSMC中表達(dá)的分子機(jī)制 AP-1是一種激活細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在AngⅡ誘導(dǎo)其前體基因表達(dá)過(guò)程中，伴有AP-1(Fos-Jun二聚體)與血管緊張素原基因啟動(dòng)子結(jié)合活性的增強(qiáng)。 為進(jìn)一步探討AngⅡ促進(jìn)AP-1與其順式元件結(jié)合的分子

5、機(jī)制。本部分實(shí)驗(yàn)用放線(xiàn)菌酮(cycloheximide，CHX)作為c-Jun的阻斷劑，觀察AngⅡ?qū)P-1與血管緊張素原基因啟動(dòng)子相互作用及對(duì)血管緊張素原基因表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.1 不同劑量CHX對(duì)VSMC活力的影響 為了觀察CHX對(duì)VSMC是否具有的毒性，用不同劑量的CHX處理VSMC后，進(jìn)行MTT分析。結(jié)果顯示，在15～45μmol/L濃度范圍內(nèi)，vSMC活力無(wú)明顯變化。提示在該濃度范圍內(nèi)，CHX對(duì)V

6、SMC不產(chǎn)生毒性作用。 1.2 AngⅡ促進(jìn)c-Jun蛋白表達(dá)與磷酸化 Western bloe結(jié)果顯示，AngⅡ作用于VSMC 0.5 h后，平明顯降低。結(jié)果提示，AngⅡ?qū)ζ淝绑w基因的正反饋調(diào)節(jié)是通過(guò)促進(jìn)AP-1表達(dá)及誘導(dǎo)c-Jun磷酸化活化而實(shí)現(xiàn)的，CHX是一種AP-1磷酸化的抑制劑。 1.3 CHX抑制AngⅡ誘導(dǎo)的血管緊張素原基因表達(dá) 用RT-PCR檢測(cè)CHX抑制c-Jun磷酸化對(duì)血管緊張素原基

7、因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，用AngⅡ處理VSMC3h，可顯著提高血管緊張素原基因的表達(dá)活性。用CHX預(yù)處理VSMC可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的血管緊張素原基因表達(dá)。由此可見(jiàn)，CHX對(duì)c-Jun磷酸化的抑制可下調(diào)血管緊張素原基因的表達(dá)活性，提示AP-1的磷酸化活化是該基因表達(dá)所必需的。 1.4 AngⅡ促進(jìn)AP-1與血管緊張素原基因啟動(dòng)子結(jié)合 為尋找AngⅡ誘導(dǎo)c-Jun磷酸化與其促進(jìn)血管緊張素原基因表達(dá)之間的關(guān)系，用EMSA檢測(cè)A

8、ngⅡ?qū)P-1與其順式元件結(jié)合活性的影響。結(jié)果顯示，AngⅡ處理VSMC 0.5 h后，核蛋白與探針的結(jié)合活性顯著升高，至3 h達(dá)高峰。分別加入抗c-Jun和抗STAT5b抗體進(jìn)行超遷移分析，均可出現(xiàn)抗體.抗原一探針形成的超遷移條帶。在CHX預(yù)處理的細(xì)胞，其核蛋白與探針的結(jié)合活性明顯下降。為了查明CHX抑制AP-1結(jié)合活性的機(jī)制，對(duì)同樣條件下收集的核蛋白進(jìn)行Westem blot分析。結(jié)果表明，CHX對(duì)AP-1結(jié)合活性的抑制效應(yīng)與AP

9、-1蛋白水平無(wú)關(guān)，而是CHX抑制AP-1磷酸化的直接結(jié)果。上述結(jié)果提示，AngⅡ誘導(dǎo)AP-1磷酸化是AngⅡ?qū)ρ芫o張素原基因正反饋調(diào)節(jié)的機(jī)制之一。 2 Roscovitine抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖與c-Jun表達(dá)之間的關(guān)系 ROSCOvitine作為一種細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶(CDKs)的特異性抑制劑，具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖的作用。但roscovitine對(duì)VSMC增殖是否具有抑制作用，以及其對(duì)VSMC的抑制

10、效應(yīng)及作用機(jī)制與其他細(xì)胞是否相同目前尚不清楚。 本部分比較roscovitine對(duì)VSMC和不同組織來(lái)源的細(xì)胞系增殖的影響及其作用機(jī)制。 2.1 Roscovitine對(duì)細(xì)胞增殖的影響 用細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。結(jié)果顯示，被血清和AngⅡ刺激后，VSMC細(xì)胞增殖速率顯著加快，分別是對(duì)照組(無(wú)血清培養(yǎng)組)的2.63和1.68倍。不同濃度的roscovitine(15、30、45μmol/L)預(yù)處理VSMC15

11、h，均可顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖。抑制率分別為37.3％、46.7％和51.8％。Roscovitine也可顯著抑制血清誘導(dǎo)的VSMC增殖。結(jié)果表明，roscovitine可顯著抑制體外培養(yǎng)的VSMC增殖。 Roscovitine也顯著抑制血清誘導(dǎo)的HeLa、COS-7、M17細(xì)胞的增殖。Roscovitine在30μmol/L時(shí)，對(duì)HeLa、COS-7、M17細(xì)胞的增殖抑制率分別為61.8％、60.4％和54.3％

12、(p<0.001)，明顯高于對(duì)VSMC的抑制作用。結(jié)果提示，不同細(xì)胞對(duì)roscovitine的敏感性有所不同。 2.2 Roscovitine對(duì)c-Jun蛋白表達(dá)的影響 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，在AngⅡ刺激的VSMC中，c-Jun表達(dá)明顯增多。Roscovitine預(yù)處理VSMC可使c-Jun的表達(dá)明顯下降。Westernblot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，AngⅡ和血清刺激VSM C可顯著誘導(dǎo)c-Jun蛋白的表達(dá)，roscov

13、itine預(yù)處理細(xì)胞15 h可顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的c-Jun表達(dá)。然而，在HeLa、COS-7和M17細(xì)胞中，roscovitine預(yù)處理細(xì)胞對(duì)c-Jun蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。在HeLa、COS-7、M17和VSMC中，roscovitine均不影響STAT5b的表達(dá)水平。結(jié)果提示，roscovitine抗VSMC增殖的作用與其抑制c-Jun表達(dá)有關(guān)；roscovitine抑制HeLa、COS-7和M17增殖與抑制c-Jun表達(dá)無(wú)關(guān)。說(shuō)

14、明roscovitine抗細(xì)胞增殖的機(jī)理在不同細(xì)胞是不同的。 2.3 Roscovitine在轉(zhuǎn)錄水平上抑制c-jun基因在VSMC中的表達(dá) 為進(jìn)一步探討roscovitine抑制c-Jun表達(dá)的作用環(huán)節(jié)，用roscovitine處理VSMC、HeLa與M17細(xì)胞后，用RT-PCR檢測(cè)c-jun基因的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果顯示，roscovitine可下調(diào)VSMC中c-jun mRNA水平，但不影響HeLa和M17細(xì)胞對(duì)c-ju

15、n mRNA的表達(dá)，與Western blot結(jié)果一致。結(jié)果提示，roscovitine通過(guò)抑制c-jun基因轉(zhuǎn)錄而導(dǎo)致VSMC中c-Jun蛋白水平下降。 3 AngⅡ促進(jìn)VSMC增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及Roscovitine抑制VSMC增殖的作用靶點(diǎn) AngⅡ通過(guò)與VSMC上的相應(yīng)受體相互作用而觸發(fā)細(xì)胞增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，最終引起細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)及VSMC大量增殖。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated

16、protein kinase，MAPK)級(jí)聯(lián)反應(yīng)是轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞增殖信號(hào)進(jìn)入細(xì)胞核的一條重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。本部分研究觀察roscovitine對(duì)MAPK信號(hào)通路以及對(duì)血管緊張素原基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡明roscovitine抑制VSMC增殖與細(xì)胞增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的關(guān)系。 4 AP-1與STAT5在調(diào)節(jié)血管緊張素原基因表達(dá)中的相互作用 AngⅡ誘導(dǎo)其前體基因表達(dá)與AP-1和STAT5磷酸化活化有關(guān)，表明AP-1與STAT5均參

17、與血管緊張素原基因的反式激活過(guò)程。本部分實(shí)驗(yàn)探討這兩種轉(zhuǎn)錄因子在血管緊張素原基因轉(zhuǎn)錄激活過(guò)程中的相互作用。 結(jié)論 1．AngⅡ通過(guò)促進(jìn)AP-1表達(dá)及磷酸化活化正反饋調(diào)節(jié)其前體基因表達(dá)。 2．ROSCOvitine通過(guò)特異性抑制c-Jun表達(dá)而發(fā)揮其對(duì)VSMC的抗增殖作用。 3．Roscovitine抑制VSMC增殖與抑制ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。 4．STAT5和c-Jun對(duì)血管緊張素原基因的