celecoxib對血管平滑肌培養(yǎng)細胞的增殖抑制、凋亡誘導作用及分子機制的研究.pdf

1、經(jīng)皮冠狀動脈內(nèi)血管成形術(percutaneous transluminal coronaryangioplasty,PTCA)已被廣泛應用于冠心病的治療，但術后6個月內(nèi)擴張部位再狹窄的發(fā)生率仍高達33％。關于再狹窄的機制主要認為和血管中膜平滑肌細胞增生有關。環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是誘導型環(huán)氧化酶，其終產(chǎn)物是前列腺素E<,2>(PGE<,2>)。COX-2和PGE2與炎癥時的炎細胞反應和腫瘤的發(fā)生發(fā)

2、展密切相關。有學者認為PTCA術后的血管平滑肌增生是一種炎癥反應。celecoxib是第一個進入臨床應用的選擇性COX-2抑制劑，已被FDA批準用于關節(jié)炎的治療和家族性多發(fā)性腸息肉病的防治，但celecoxib能否抑制血管平滑肌的增生，并通過局部用藥達到防治PTCA術后再狹窄的發(fā)生尚不清楚。本課題通過celecoxib對血管平滑肌細胞(vascular smoothmuscle cell，VSMC)體外作用的實驗研究，探討了celeco

3、xib抑制培養(yǎng)動脈血管平滑肌細胞增生的作用及其機制。 研究目的：1.觀察COX-2在血管平滑肌細胞中的表達情況。2.觀察celecoxib在體外對血管平滑肌細胞抑制增殖、誘導凋亡的生物學效應。3.初步探討celecoxib抑制血管平滑肌細胞增殖、誘導凋亡可能的分子機制。 4.制備PLGA-celecoxib緩釋微球。 研究方法：1.細胞培養(yǎng)：取大鼠胸主動脈做血管平滑肌細胞原代培養(yǎng)，傳代后按常規(guī)方法培養(yǎng)。2.Western

4、 blot實驗檢測血管平滑肌培養(yǎng)細胞中COX-2蛋白表達水平。3.倒置顯微鏡觀察celecoxib對細胞生長的影響。4.細胞生長和活性測定(WST-1)實驗檢測celecoxib處理后血管平滑肌培養(yǎng)細胞增殖的變化。5.流式細胞儀檢測藥物處理后血管平滑肌培養(yǎng)細胞的凋亡指數(shù)。6.Western blot實驗檢測celecoxib用藥前后caspase-3的激活片段、Akt(Thr<'308>)磷酸化水平的改變。7.乳劑溶解蒸發(fā)法制備cele

5、coxib-PLGA緩釋微球，倒置顯微鏡下觀察微球形態(tài)。 研究結果：1.Western blot實驗結果顯示，培養(yǎng)的血管平滑肌細胞中能夠檢測到COX-2蛋白的表達。2.倒置顯微鏡下觀察，celecoxib處理后，隨著時間和濃度的增加，培養(yǎng)平滑肌細胞的胞體皺縮，變圓，漂浮細胞增多。3.WST-1實驗結果顯示，以0、6.25、12.5、25、50μM/L celecoxib分別處理細胞24小時，相對應的細胞生長率分別為100％，81

6、.15％，66.72％，54.93％和11.41％。細胞生長抑制作用呈劑量依賴性關系。 4.流式細胞儀檢測結果顯示，50μM/L celecoxib作用24小時時，培養(yǎng)血管平滑肌細胞的凋亡率為30.72％。5.Western blot結果顯示，celecoxib處理24小時后可以檢測到caspase-3被激活時的20kd片段，激活片段的條帶深度與celecoxib的藥物濃度相關；celecoxib處理培養(yǎng)的血管平滑肌細胞2小時后Akt(

7、Thr<'308>)的磷酸化水平明顯降低。6.倒置顯微鏡下觀察PLGA-celecoxib微球：微球均勻圓整，不粘連，球體均勻度好，粒徑分布較均勻直徑約為1～5μm，微球形態(tài)可維持至14天以上。 研究結論：1.大鼠血管平滑肌培養(yǎng)細胞中可檢測到COX-2蛋白表達。2.COX-2選擇性抑制劑celecoxib對血管平滑肌細胞有明顯的增殖抑制作用，并可誘導細胞發(fā)生凋亡，該效應呈劑量依賴性。3.Celecoxib'~導細胞發(fā)生凋亡的機制