celecoxib對(duì)血管平滑肌培養(yǎng)細(xì)胞的增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)作用及分子機(jī)制的研究.pdf

1、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈內(nèi)血管成形術(shù)(percutaneous transluminal coronaryangioplasty,PTCA)已被廣泛應(yīng)用于冠心病的治療，但術(shù)后6個(gè)月內(nèi)擴(kuò)張部位再狹窄的發(fā)生率仍高達(dá)33％。關(guān)于再狹窄的機(jī)制主要認(rèn)為和血管中膜平滑肌細(xì)胞增生有關(guān)。環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是誘導(dǎo)型環(huán)氧化酶，其終產(chǎn)物是前列腺素E<,2>(PGE<,2>)。COX-2和PGE2與炎癥時(shí)的炎細(xì)胞反應(yīng)和腫瘤的發(fā)生發(fā)

2、展密切相關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為PTCA術(shù)后的血管平滑肌增生是一種炎癥反應(yīng)。celecoxib是第一個(gè)進(jìn)入臨床應(yīng)用的選擇性COX-2抑制劑，已被FDA批準(zhǔn)用于關(guān)節(jié)炎的治療和家族性多發(fā)性腸息肉病的防治，但celecoxib能否抑制血管平滑肌的增生，并通過局部用藥達(dá)到防治PTCA術(shù)后再狹窄的發(fā)生尚不清楚。本課題通過celecoxib對(duì)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smoothmuscle cell，VSMC)體外作用的實(shí)驗(yàn)研究，探討了celeco

3、xib抑制培養(yǎng)動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增生的作用及其機(jī)制。 研究目的：1.觀察COX-2在血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)情況。2.觀察celecoxib在體外對(duì)血管平滑肌細(xì)胞抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的生物學(xué)效應(yīng)。3.初步探討celecoxib抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡可能的分子機(jī)制。 4.制備PLGA-celecoxib緩釋微球。 研究方法：1.細(xì)胞培養(yǎng)：取大鼠胸主動(dòng)脈做血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)，傳代后按常規(guī)方法培養(yǎng)。2.Western

4、 blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血管平滑肌培養(yǎng)細(xì)胞中COX-2蛋白表達(dá)水平。3.倒置顯微鏡觀察celecoxib對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。4.細(xì)胞生長(zhǎng)和活性測(cè)定(WST-1)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)celecoxib處理后血管平滑肌培養(yǎng)細(xì)胞增殖的變化。5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物處理后血管平滑肌培養(yǎng)細(xì)胞的凋亡指數(shù)。6.Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)celecoxib用藥前后caspase-3的激活片段、Akt(Thr<'308>)磷酸化水平的改變。7.乳劑溶解蒸發(fā)法制備cele

5、coxib-PLGA緩釋微球，倒置顯微鏡下觀察微球形態(tài)。 研究結(jié)果：1.Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞中能夠檢測(cè)到COX-2蛋白的表達(dá)。2.倒置顯微鏡下觀察，celecoxib處理后，隨著時(shí)間和濃度的增加，培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞的胞體皺縮，變圓，漂浮細(xì)胞增多。3.WST-1實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以0、6.25、12.5、25、50μM/L celecoxib分別處理細(xì)胞24小時(shí)，相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)率分別為100％，81

6、.15％，66.72％，54.93％和11.41％。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用呈劑量依賴性關(guān)系。 4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，50μM/L celecoxib作用24小時(shí)時(shí)，培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞的凋亡率為30.72％。5.Western blot結(jié)果顯示，celecoxib處理24小時(shí)后可以檢測(cè)到caspase-3被激活時(shí)的20kd片段，激活片段的條帶深度與celecoxib的藥物濃度相關(guān)；celecoxib處理培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞2小時(shí)后Akt(

7、Thr<'308>)的磷酸化水平明顯降低。6.倒置顯微鏡下觀察PLGA-celecoxib微球：微球均勻圓整，不粘連，球體均勻度好，粒徑分布較均勻直徑約為1～5μm，微球形態(tài)可維持至14天以上。 研究結(jié)論：1.大鼠血管平滑肌培養(yǎng)細(xì)胞中可檢測(cè)到COX-2蛋白表達(dá)。2.COX-2選擇性抑制劑celecoxib對(duì)血管平滑肌細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，并可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，該效應(yīng)呈劑量依賴性。3.Celecoxib'~導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制