MicroRNA-210在尋常型銀屑病皮損中的表達及其對角質(zhì)形成細胞的影響.pdf

1、目的:
　　研究尋常型銀屑病皮損中miR-210表達變化;預測及驗證miR-210的靶基因;研究尋常型銀屑病皮損中靶基因RUNX3蛋白表達變化;研究抑制miR-210表達對HacaT細胞RUNX3蛋白的表達、細胞增殖、凋亡、細胞周期的影響。
　　方法:
　　取20例尋常型銀屑病患者皮損和16例正常對照者皮膚組織，用TRIzol試劑提取總RNA，用蛋白質(zhì)抽屜試劑盒提取總蛋白，應用Real-time PCR法對20例尋常型

2、銀屑病患者和16例正常對照檢測miR-210的表達水平，應用western blot法檢測蛋白表達水平。運用Mirbase/Targetscans/PicTar等靶基因預測軟件查找miR-210可能的靶基因，篩選出與尋常型銀屑病發(fā)病過程密切相關的基因作為候選靶基因，我們選定RUNX3為靶基因。構(gòu)建RUNX3野生型（RUNX3WT-luciferase）和突變型（RUNX3Mut-luciferase）熒光素酶報告基因，與miR-210模

3、擬物(miR-210 mimic)和陰性對照(mimiccontrol)用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染至HacaT細胞，轉(zhuǎn)染48小時后收集細胞，運用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，以海腎熒光素酶作為內(nèi)參照，檢測螢火蟲熒光素酶的活性，在HacaT細胞中驗證miR-210是否調(diào)控RUNX3表達。使用miR-210抑制物(miR-210 inhibitor)和陰性對照（miR-210 inhibitor control），脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HacaT細胞，采用Real

4、-time PCR法檢測轉(zhuǎn)染后miR-210的表達，采用Western blot法檢測RUNX3蛋白表達水平，MTT法檢測細胞活力，流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期。
　　結(jié)果:
　　1.Real-time PCR結(jié)果顯示:miR-210在尋常型銀屑病患者組皮損中表達較正常對照組顯著降低(p＜0.05)。western blot檢測結(jié)果顯示:相對于正常對照組，尋常型銀屑病組皮損中RUNX3的蛋白表達水平顯著升高(P＜0.05

5、)。尋常型銀屑病皮損中miR-210表達水平與RUNX3蛋白表達水平呈顯著負相關（r=-0.849，p=0.002）。
　　2.在HacaT細胞中共轉(zhuǎn)染miR-210 mimic或miR-210 mimiccontrol與RUNX3基因3'-UTR野生型報告載體(RUNX3WT-luciferase)或突變型報告載體（RUNX3Mut-luciferase），熒光素酶報告基因檢測顯示:與共轉(zhuǎn)染miR-210 mimic contr

6、ol和RUNX3WT-luciferase組相比，共轉(zhuǎn)染miR-210 mimic和RUNX3WT-luciferase組熒光素酶活性被顯著抑制(p＜0.05)，而當RUNX3-3'-UTR突變修飾后（RUNX3Mut-luciferase），熒光素酶活性無顯著改變(P＞0.05)。
　　3.轉(zhuǎn)染miR-210 inhibitor的HacaT細胞相對于轉(zhuǎn)染miR-210inibitor control組miR-210表達水平降低，

7、RUNX3蛋白表達水平升高，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，細胞增殖活力明顯增加，凋亡水平下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，細胞周期各期無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.尋常型銀屑病患者皮損中miR-210表達降低。
　　2.RUNX3為miR-210的靶基因，miR-210通過作用于RUNX33'-UTR區(qū)抑制報告基因表達，miR-210通過與靶基因RUNX3結(jié)合影響RUNX3蛋白