C-EBPα調(diào)控角質(zhì)表成細(xì)胞增殖和分化在尋常型銀屑病皮損形成中的作用.pdf

1、銀屑病(Psoriasis)又稱“牛皮癬”，是臨床常見的一種有遺傳背景的與免疫反應(yīng)異常有關(guān)的紅斑鱗屑性皮膚病，國內(nèi)發(fā)病率約0.123％-0.470％。銀屑病最早于公元前三百多年由蘇格拉底首先報(bào)道，是人類認(rèn)識的最古老的疾病之一，其易復(fù)發(fā)、難治愈，嚴(yán)重影響患者的身心健康，影響程度與心肌梗死、高血壓及2型糖尿病相當(dāng)，甚至約15.9％的銀屑病患者曾有過輕生的想法。然而，銀屑病確切的病因和發(fā)病機(jī)制至今仍未完全闡明，是皮膚科領(lǐng)域亟待解決的難題之一。

2、
　　國內(nèi)外對銀屑病的病因及發(fā)病機(jī)制均進(jìn)行了較多的研究，雖然取得了一定進(jìn)展，但至今尚未完全闡明。目前認(rèn)為銀屑病的發(fā)病機(jī)制與遺傳因素、免疫因素、感染因素、內(nèi)分泌因素、神經(jīng)精神因素及生活習(xí)慣、藥物和環(huán)境因素等密切相關(guān)，多種因素的共同作用最終導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化、凋亡異常和真皮乳頭層血管內(nèi)皮細(xì)胞的異常新生，形成了臨床可見的銀屑病特征性皮損，表現(xiàn)為表面覆蓋銀白色鱗屑的紅色斑塊，具有薄膜現(xiàn)象、蠟滴現(xiàn)象和Auspitz征。
　　

3、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)是轉(zhuǎn)錄因子C/EBP家族中的重要成員，該基因最早于小鼠的NIH-3T3細(xì)胞中被克隆，定位于7號染色體上。C/EBPα位于人類染色體19q13.1，cDNA全長2385bp，內(nèi)含多個翻譯起始位點(diǎn)。C/EBPα在脂肪細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、肝細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和肺泡細(xì)胞等正常組織的發(fā)育、細(xì)胞增殖與分化的調(diào)節(jié)、磷脂的合成與代謝中發(fā)揮重要作用。C/EBPα表達(dá)在表皮的基底層，角質(zhì)形成細(xì)胞中C/EBPα的過表達(dá)

4、可導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯。C/EBPα在小鼠和人類表皮中高表達(dá)，表明其在復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞的分化中起轉(zhuǎn)錄因子的作用。癌基因Ras的過表達(dá)導(dǎo)致永生化角質(zhì)形成細(xì)胞中C/EBPα減少，從而使C/EBPα抑制細(xì)胞增殖的能力減弱。皮脂腺中C/EBPα與C/EBPβ的迅速聯(lián)合消融導(dǎo)致硬脂酰CoA去飽和酶(SCD3)和黑皮素5受體(FC5R)的表達(dá)減少，最終引起嚴(yán)重的形態(tài)缺陷和皮脂細(xì)胞分化受阻。由此可見，C/EBPα對于正常皮膚中表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化

5、發(fā)揮重要的調(diào)控作用。那么，在以角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和分化異常為基礎(chǔ)的尋常型銀屑病皮損中，C/EBPα如何表達(dá)？是否參與了病理改變的過程呢？目前未見國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道。
　　為明確C/EBPα在銀屑病發(fā)病中的作用，本研究從mRNA和蛋白水平檢測尋常型銀屑病皮損中C/EBPα的表達(dá)，并與角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖及臨床皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PAS(I)評分）之間進(jìn)行相關(guān)性分析，旨在探討其異常表達(dá)的臨床意義。應(yīng)用針對C/EBPα的siRNA沉默人原

6、代角質(zhì)形成細(xì)胞C/EBPα基因的表達(dá)，探究C/EBPα基因?qū)琴|(zhì)形成細(xì)胞增殖和分化的影響。采用銀屑病發(fā)病過程中Th17和Th22細(xì)胞分泌的關(guān)鍵細(xì)胞因子IL-22刺激角質(zhì)形成細(xì)胞，檢測MAPK信號通路中關(guān)鍵信號分子JNK、ERK、p38的磷酸化水平及C/EBPα的表達(dá)水平，探究IL-22是否能夠通過MAPK信號通路調(diào)控C/EBPα的表達(dá)，參與尋常型銀屑病皮損的形成過程。
　　第一部分:C/EBPαmRNA和蛋白在人健康皮膚及銀屑病皮

7、損中的表達(dá)及意義
　　目的
　　探究C/EBPαmRNA和蛋白在尋常型銀屑病皮損中的表達(dá)及其與角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖和銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(PASI)評分之間的相關(guān)性。
　　方法
　　1、標(biāo)本收集:收集2011年1月-2011年12月山東大學(xué)齊魯醫(yī)院皮膚科病理室留存的尋常型銀屑病蠟塊標(biāo)本共計(jì)30例。診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《臨床診療指南—皮膚病與性病分冊》（中華醫(yī)學(xué)會編著，人民衛(wèi)生出版社）、《臨床技術(shù)操作規(guī)范—皮膚病與

8、性病分冊》（中華醫(yī)學(xué)會編著，人民軍醫(yī)出版社）、《中國銀屑病治療指南》（中華醫(yī)學(xué)會皮膚科分會銀屑病學(xué)組，2008年）。所有患者在本次發(fā)病以來均未經(jīng)系統(tǒng)治療，符合入組標(biāo)準(zhǔn)（詳見正文）。另選取本院皮膚科留取的健康對照皮膚標(biāo)本30例，在年齡、性別、取材部位上與尋常型銀屑病組相匹配。
　　2、免疫組化法檢測C/EBPα的表達(dá):采用免疫組化二步法檢測尋常型銀屑病皮損和健康對照組織中C/EBPα的表達(dá)，以灰度值代表C/EBPα的表達(dá)水平，采用I

9、mageJ2.1.4.7軟件分析計(jì)算灰度值，兩組之間的灰度值采用t檢驗(yàn)。
　　3、C/EBPα的表達(dá)與角質(zhì)形成細(xì)胞增殖指數(shù)及PASI評分之間的相關(guān)性分析:免疫組化法檢測Ki-67的表達(dá)，根據(jù)Ki-67的陽性表達(dá)，計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)，采用Pearson相關(guān)性分析，統(tǒng)計(jì)分析C/EBPα的表達(dá)水平與PI及PASI評分之間的相關(guān)性。
　　4、RT-PCR和WesternBlot法檢測銀屑病皮損和健康對照組織中C/EBPαmRN

10、A和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果
　　1、患者臨床資料:30例尋常型銀屑病患者中，年齡15-49歲，平均25.2歲，其中男28例、女12例，皮損發(fā)生于頭面部10例，軀干10例，四肢10例。
　　2、C/EBPα主要在角質(zhì)形成細(xì)胞胞漿中表達(dá)，尋常型銀屑病皮損中C/EBPα的表達(dá)較健康對照皮膚明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.819,P＜0.05)。
　　3、Ki-67主要在角質(zhì)形成細(xì)胞胞核中表達(dá)，尋常型銀屑病皮損中角

11、質(zhì)形成細(xì)胞的增殖指數(shù)明顯高于健康對照皮膚，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.535,P＜0.05)。
　　4、經(jīng)Pearson相關(guān)分析，尋常型銀屑病皮損中C/EBPα的灰度值與增殖指數(shù)呈正相關(guān)(r=0.654，P＜0.05)，與銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(PASI評分)呈正相關(guān)(r=0.693，P＜0.05)。
　　5、RT-PCR及WesternBlot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，尋常型銀屑病皮損中C/EBPαmRNA和蛋白的表達(dá)水平較健康

12、對照皮膚中明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tRT-PCR=2.981,twestern=2.756,P＜0.05)。
　　結(jié)論
　　C/EBPαmRNA和蛋白在尋常型銀屑病皮損中表達(dá)明顯下調(diào)，其蛋白的表達(dá)水平與角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖指數(shù)及銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(PAS(I)評分)呈負(fù)相關(guān)。由此推測C/EBPα蛋白可能參與了尋常型銀屑病皮損中角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖的過程，可作為一種反映尋常型銀屑病皮損嚴(yán)重程度的指標(biāo)。
　　

13、第二部分:C/EBPα基因在角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)及沉默C/EBPα基因?qū)?xì)胞增殖、分化的影響
　　目的
　　1、探究原代培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細(xì)胞中C/EBPαmRNA和蛋白的表達(dá)
　　2、探究siRNA介導(dǎo)的C/EBPα基因沉默對原代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、分化的影響。
　　方法
　　1、原代細(xì)胞培養(yǎng):本研究采用原代培養(yǎng)的人皮膚表皮角質(zhì)形成細(xì)胞。皮膚標(biāo)本取自山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院小兒外科（泌尿外科組）術(shù)中留取

14、的幼兒包皮標(biāo)本，在實(shí)驗(yàn)室中PBS沖洗血污，碘伏浸泡消毒，PBS徹底沖洗后，切成小塊，0.25％胰酶4℃消化過夜，待表、真皮分離后取下表皮，0.25％胰酶-0.01％EDTA消化液中消化成單細(xì)胞，加入Epilife-HKGS培養(yǎng)液，37℃、5％CO2、飽和濕度條件下貼壁培養(yǎng)，隔天換液1次，待細(xì)胞融合至70％時傳代，傳代2-3次后黑素細(xì)胞、成纖維細(xì)胞即可全部死亡，得到純凈的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)物，經(jīng)鑒定后取第3代、第4代細(xì)胞用于后續(xù)研究工作。<

15、br>　　2、C/EBPαsiRNA的轉(zhuǎn)染:C/EBPαsiRNA由山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物發(fā)育與基因調(diào)控實(shí)驗(yàn)室張燕君教授饋贈，已經(jīng)過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率、干擾效率及轉(zhuǎn)染濃度等，由德國QIAGEN公司合成。將對數(shù)生長期的角質(zhì)形成細(xì)胞以2×105個/well數(shù)目接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到70％左右，用脂質(zhì)體lipofectamine2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞，步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。
　　3、C/EBPα基因干擾效率的檢測:轉(zhuǎn)染后24

16、h收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用RT-PCR法檢測細(xì)胞中C/EBPα基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后72h收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用WesternBlot法檢測細(xì)胞中C/EBPα蛋白的表達(dá)。
　　4、CCK-8法檢測C/EBPα基因沉默對角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響:取對數(shù)生長期siRNA轉(zhuǎn)染組、空載體組和空白對照組的細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)后按5×103個/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于第12、24、48、72h采用CCK-8比色法檢測各組細(xì)胞增殖情況

17、。
　　5、角質(zhì)形成細(xì)胞分化標(biāo)志蛋白CK10、Involucrin的表達(dá):收集轉(zhuǎn)染后72h的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用WesternBlot法檢測CK10、Involucrin蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果
　　1、C/EBPαsiRNA能夠有效下調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞C/EBPα基因的表達(dá):siRNA轉(zhuǎn)染后24h，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中C/EBPαmRNA的表達(dá)均較對照組下降47％;轉(zhuǎn)染后72h，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞C/EBPα蛋白表達(dá)亦顯著下調(diào)（

18、P＜0.05)。
　　2、應(yīng)用CCK-8法檢測C/EBPα基因沉默后角質(zhì)形成細(xì)胞增殖活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)種板后第12hsiRNA轉(zhuǎn)染組、空載體組、空白對照組三組角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖活性未見明顯差異(P＞0.05)，第24h開始，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖活性與空白對照組相比出現(xiàn)降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異（第24、48、72h的P＜0.05)。
　　3、應(yīng)用WesternBlot法檢測CK10、Involucrin蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染第72

19、h后，角質(zhì)形成細(xì)胞分化的標(biāo)志蛋白CK10、Involucrin表達(dá)水平較空白對照組明顯下調(diào)，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論
　　1、C/EBPαsiRNA能夠有效的抑制角質(zhì)形成細(xì)胞中C/EBPα的表達(dá)，C/EBPα基因沉默后角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖率提高、分化水平降低。
　　2、C/EBPα基因是治療角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、分化異常性疾病的潛在靶基因。
　　第三部分:IL-22刺激對角質(zhì)形成細(xì)胞MAPK信號通

20、路及C/EBPα表達(dá)的影響
　　目的
　　1、探究IL-22對角質(zhì)形成細(xì)胞MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白磷酸化水平的影響
　　2、探究IL-22對角質(zhì)形成細(xì)胞C/EBPα基因表達(dá)的影響
　　3、探究IL-22對角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和分化的影響及其與C/EBPα基因表達(dá)水平的相關(guān)性
　　方法
　　1、原代細(xì)胞培養(yǎng):同第二部分
　　2、IL-22刺激角質(zhì)形成細(xì)胞:以原代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞為研究對象，待細(xì)胞融合

21、至60％左右時，加入終濃度為30ng/mL、60ng/mL、90ng/mL的人IL-22融合蛋白，在加藥刺激后不同時間點(diǎn)收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
　　3、WesternBlot法檢測MAPK信號通路中關(guān)鍵分子的磷酸化水平:IL-22刺激后60min收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用WesternBlot法檢測細(xì)胞中JNK、p-JNK、p38、p-p38、ERK、p-ERK的表達(dá)水平。
　　4、CCK-8法檢測IL-22刺激對角質(zhì)形

22、成細(xì)胞增殖的影響:取對數(shù)生長期角質(zhì)形成細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)后按5×103個/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入終濃度為30ng/mL、60ng/mL、90ng/mL的人IL-22融合蛋白，于加藥后第12、24、48、72h采用CCK-8比色法檢測各組細(xì)胞增殖情況。
　　5、WesternBlot法檢測IL-22刺激對角質(zhì)形成細(xì)胞分化標(biāo)志蛋白CK10、Involucrin表達(dá)的影響:IL-22刺激后48h收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用Wes

23、ternBlot法檢測細(xì)胞中CK10、Involucrin蛋白的表達(dá)水平。
　　6、RT-PCR和WesternBlot法檢測C/EBPαmRNA和蛋白的表達(dá)水平:IL-22刺激后48h收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA和總蛋白，應(yīng)用RT-PCR和WesternBlot法檢測細(xì)胞中C/EBPαmRNA和蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果
　　1、IL-22刺激可顯著上調(diào)JNK、ERK、p38的磷酸化水平:IL-22刺激后60min，p

24、-JNK、p-ERK、p-p38均較對照組表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、IL-22可顯著促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖:應(yīng)用CCK-8比色法檢測發(fā)現(xiàn)，種板后第12h開始，細(xì)胞增殖率明顯升高(P＜0.05)，呈明顯的時間和劑量依賴性。
　　3、IL-22可顯著抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的分化:WesternBlot檢測發(fā)現(xiàn)，60ng/mL的IL-22可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞分化標(biāo)志蛋白CK10、Involucrin的表達(dá)水平

25、（P＜0.05)，且呈明顯的濃度依賴性。
　　4、IL-22可顯著下調(diào)C/EBPαmRNA和蛋白的表達(dá)水平:RT-PCR和WesternBlot檢測發(fā)現(xiàn)，IL-22可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞C/EBPαmRNA和蛋白的表達(dá)水平(P＜0.05)，且呈明顯的濃度依賴性。
　　結(jié)論
　　1、IL-22可以顯著調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和分化過程。
　　2、IL-22可顯著調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞中MAPK信號通路及C/EBPα的表達(dá)水平。