TFAP-2B基因變化在動脈導(dǎo)管未閉發(fā)生中的作用研究.pdf

1、研究背景和目的：動脈導(dǎo)管為胎兒降主動脈與左肺動脈之間的正常通道，正常情況下，足月新生兒出生后由于血氧分壓的升高和前列腺素濃度降低，約15小時內(nèi)大多功能性關(guān)閉，80％嬰兒在出生后3個月內(nèi)解剖性關(guān)閉。一般認為，動脈導(dǎo)管未閉（patent ductus arteriosus，PDA）的發(fā)生與早產(chǎn)、出生后缺氧、高原低氧、遺傳因素有關(guān)。作為一種常見的先天性心血管發(fā)育畸形，PDA在足月活產(chǎn)新生兒中的發(fā)病率約為0.5‰，占先天性心臟病的10％左右。T

2、FAP2B基因從屬于TFAP家族，定位于人類染色體6q12，包含7個外顯子主要負責(zé)合成神經(jīng)管嵴相關(guān)轉(zhuǎn)錄蛋白。TFAP家族蛋白產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)高度的保守性，C端基本都含有helix-span-helix二聚體區(qū)域和包括GCCN3/4GGC共有序列在內(nèi)的DNA結(jié)合區(qū)域。TFAP2B蛋白產(chǎn)物往往通過與其他轉(zhuǎn)錄蛋白形成異源二聚體調(diào)控下游基因的表達，參與哺乳動物心臟、腎臟、神經(jīng)管等多組織器官的生長發(fā)育，調(diào)控相關(guān)細胞的增殖及凋亡。2000年，Sat

3、oda等研究發(fā)現(xiàn)TFAP2B基因錯義突變可造成Char綜合癥，一類以動脈導(dǎo)管未閉為主的先天性心臟缺陷合并不同程度的面部畸形（低耳廓、人中較短、嘴唇扁厚等）和指關(guān)節(jié)畸形（小指屈曲障礙、多指等）為特征的疾病。當(dāng)時研究認為，TFAP2B可通過C端的DNA結(jié)合區(qū)域與GAS41等細胞因子相互作用，形成二聚體結(jié)構(gòu)調(diào)控下游基因表達。當(dāng)TFAP2B因突變影響到其DNA結(jié)合區(qū)域功能時，就會干擾TFAP2B與其他基因正常結(jié)合，進而引發(fā)包括Char綜合癥在內(nèi)

4、的多種疾病。Satoda的研究同時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)同一細胞中包含TFAP2B野生型與突變型時，TFAP2B的正常功能仍會受到抑制，這種現(xiàn)象被稱為顯性負相或顯性抑制。而之后Arya等學(xué)者在兩例PDA家系中研究發(fā)現(xiàn)，家系中PDA患者存在TFAP2B基因內(nèi)含子與外顯子連接區(qū)的點突變，并影響到TFAP2B基因的正常轉(zhuǎn)錄，但同樣的突變也發(fā)現(xiàn)于正常對照組中，據(jù)此Arya等認為除了顯性抑制機制之外，TFAP2B基因突變導(dǎo)致正常TFAP2B基因表達量降低同樣可

5、導(dǎo)致包括動脈導(dǎo)管未閉在內(nèi)的疾病發(fā)生，即TFAP-2B突變致單倍型效率不足假說，但是在Arya的研究病例中，部分病例僅表現(xiàn)為動脈導(dǎo)管未閉，并不涉及其他疾病，作者也考慮TFAP-2B基因突變是否同樣可引起單純性PDA。2008年，Khetyar等的一項研究證實，在單純性PDA家系中，存在TFAP-2B基因突變，但具體致病機制并不明確。因此，對PDA潛在致病基因TFAP-2B進行深入研究將有助于遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷，進而進行產(chǎn)前干預(yù)，提高患兒的

6、存活率和生存質(zhì)量，并有可能在不久的將來將基因治療引入到先心病的防治中。這對于減輕家庭和社會沉重的經(jīng)濟負擔(dān)，提高人口素質(zhì)具有重大的現(xiàn)實意義，符合《國家中長期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要（2006-2020年）》提出的“將出生缺陷防治列為優(yōu)先主題”的政策。
　　 方法：實驗組為100例單純性PDA患兒，男性38例，女性62例，平均年齡3.64±2.67歲；2例PDA家系（家系A(chǔ)、B）。所有入組患者均經(jīng)二維超聲心動圖檢查明確主動脈與肺動脈或

7、肺動脈分支間動脈導(dǎo)管開放，彩色多普勒超聲可見動脈導(dǎo)管內(nèi)血流信號，同時排除PDA合并其他類型先天性心臟缺陷。以100名健康兒童為對照，對照組兒童均經(jīng)超聲心動圖檢查證實心內(nèi)結(jié)構(gòu)正常，平均年齡（4.93±1.14）歲，其中男性44例，女性56例。PDA組與對照組間男女性別比無顯著差異（P>0.05），PDA組平均年齡小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并得到上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心醫(yī)學(xué)倫理委員會

8、的批準(zhǔn)。經(jīng)知情同意后采集外周靜脈血2ml，置于檸檬酸鈉抗凝管中，混勻后-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。?yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）擴增TFAP-2B基因的全部外顯子和外顯子兩側(cè)部分內(nèi)含子，并對擴增片段進行雙向測序。應(yīng)用BLAST程序?qū)⑺鶞yTFAP-2B基因序列與GeneBank中的已知序列進行對比以檢測基因突變。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polyme

9、rase chain reaction, RT-PCR）對2例家族史陽性患兒及其家屬 TFAP-2B部分cDNA片段進行擴增，擴增產(chǎn)物直接進行雙向序列測定。
　　 結(jié)果：基因分析顯示，在PDA家系A(chǔ)中，患兒及其患病親屬TFAP-2B第3內(nèi)含子剪接位點+5位發(fā)生突變c.601+5G>A，患兒TFAP-2B基因部分cDNA巢式PCR擴增結(jié)果提示3號外顯子完全缺失；上述結(jié)果未在該家系中正常人群及對照組中檢出。PDA家系B基因檢測結(jié)果提

10、示，在該家系所有PDA患者TFAP-2B基因第2外顯子存在c.435_438delCCGG移碼突變，最終使原來第179位纈氨酸轉(zhuǎn)換為終止密碼子p.Arg145Argfsx45；此突變未在該家系中正常人及對照組中發(fā)現(xiàn)。此外，研究還在非編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)2個新的單核苷酸多態(tài)（single nucleotide polymorphisms，SNP），c.1-34G>A和c.539+62G>C。其中，c.1-34G>A在PDA組等位基因頻率及基因型頻率

11、均高于對照組（等位基因頻率比較：Z =－2.513，P =0.012；基因型頻率比較：Z =－2.680，P =0.007）；c.539+62G>C等位基因頻率及基因型頻率在兩組中無顯著差異（等位基因頻率比較：Z =－0.332，P =0.74；基因型頻率比較：Z =－0.129，P =0.897）。
　　 結(jié)論： PDA患者中存在TFAP-2B基因突變；TFAP-2B基因突變c.601+5G>A、c.435_438delCCG