超聲微泡介導bcl-xl基因抗視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡作用的實驗研究.pdf

1、目的：探討超聲微泡介導報告基因在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)中的轉(zhuǎn)染效率、優(yōu)化轉(zhuǎn)染的條件及毒性。評價超聲微泡介導bcl-xl基因抗RGCs凋亡作用。 方法：第一步：體外培養(yǎng)RGCs。 第二步：以綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)基因為報告基因，微泡造影劑(聲諾維)為載體，用超聲基因轉(zhuǎn)染治療儀輻照介導GFP真核表達質(zhì)粒pEGFP—M轉(zhuǎn)染RGCs。實驗組為質(zhì)粒組(a組)、微泡+質(zhì)粒組(b組

2、)、超聲+質(zhì)粒組(c組)、超聲+微泡+質(zhì)粒組(d組)。d組根據(jù)轉(zhuǎn)染條件不同進一步分成不同亞組。對照組為空白對照組(e組)及脂質(zhì)體組(f組)。熒光顯微鏡和流式細胞儀觀察GFP表達情況，MTT法測定RGCs的活性。 第三步：建立N一甲基一D一天冬氨酸(NMDA)誘導的RGCs凋亡模型。將體外培養(yǎng)的RGCs分為正常對照組(A組)，NMDA誘導組(B組)，bc卜xl基因轉(zhuǎn)染-}-NMDA誘導組(C組)。C組在加入NlvlDA前48h采用

3、第二步實驗得的最佳轉(zhuǎn)染效率參數(shù)，超聲微泡介導bc卜xl基因轉(zhuǎn)染GRCs，轉(zhuǎn)染48h后采用免疫組化分析轉(zhuǎn)染細胞和未轉(zhuǎn)染細胞的bc卜xl蛋白水平。加入NMDA36h后采用A0／EB(吖啶橙／溴化乙錠)雙熒光染色檢測細胞凋亡的形態(tài)特征，瓊脂糖電泳檢測細胞凋亡的DNA片斷。 結(jié)果：1．采用多聚賴氨酸聯(lián)合鼠尾膠原作為貼壁基質(zhì)的RGCs生長良好，部分細胞伸出突起，且突起相互連接成網(wǎng)狀。 2．超聲微泡介導GFP基因轉(zhuǎn)染RGCs在優(yōu)化轉(zhuǎn)

4、染條件下即頻率300KHz，聲強1．25W／cm2，連續(xù)波，照射時間60s，微泡濃度45g~ml，質(zhì)粒濃度50p~ml，24孔板培養(yǎng)的RGCs轉(zhuǎn)染率較高，為(26．87±3．12)％，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染率為(14．21±2．59)％，兩種轉(zhuǎn)染法之間的差異有統(tǒng)計學意義(t值=36．45，P

5、染細胞與未轉(zhuǎn)染細胞的bcl-xl蛋白表達水平有差異，加入NMDA36h后AO／EB檢測發(fā)現(xiàn)B組可見大量凋亡小體，C組可見少許凋亡細胞。瓊脂糖電泳檢測亦發(fā)現(xiàn)B組呈典型DNA“梯度”條帶，而A組和C組無明顯DNA“梯度”條帶。 結(jié)論：1．RGCs能在體外成功培養(yǎng)；多聚賴氨酸聯(lián)合鼠尾膠原是RGCs體外生長的良好支持物。 2．在一定條件下，超聲破裂微泡能增強基因的轉(zhuǎn)染與表達，有望成為一種安全、有效的基因載體。 3．bcl