LEDGFp52對(duì)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞作用研究.pdf

1、[背景]： 提高損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)存活和再生能力的研究是眼科和神經(jīng)生物學(xué)科共同關(guān)注的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)。具有神經(jīng)保護(hù)性效能的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是實(shí)現(xiàn)視覺(jué)系統(tǒng)中樞神經(jīng)修復(fù)基因治療和移植的前提和物質(zhì)基礎(chǔ)。然而，既往的研究多集中在某種生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)因子的單一研究，迄今為止，還未能找到一種因子能對(duì)RGC提供持續(xù)的營(yíng)養(yǎng)支持作用足以克服其周?chē)脑偕种骗h(huán)境而促進(jìn)損傷的軸突再生。如果能尋找到某種在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄前作用的因子，則該因子有可能啟動(dòng)R

2、GC生長(zhǎng)的極鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，軸突再生的難題也就迎刃而解了。晶狀體來(lái)源的上皮生長(zhǎng)因子(lensepitheliumderivedgrowthfactor,LEDGF)是2000年新發(fā)現(xiàn)的一種新的生長(zhǎng)、粘附、分化、抗凋亡和存活因子，它能提高多數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)粘附能力、促進(jìn)其分化、延長(zhǎng)其存活。LEDGF基因位于人類(lèi)染色體9p21，該基因選擇性的剪切而產(chǎn)生兩種蛋白，即LEDGFp75和LEDGFp52蛋白。相比LEDGFp52而言，LEDGFp75只是一個(gè)

3、弱的轉(zhuǎn)錄輔活化子。最近的研究表明LEDGFp75能促進(jìn)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)與存活，譬如對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞所發(fā)揮的生長(zhǎng)刺激和促進(jìn)存活效應(yīng)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)LEDGF在腦內(nèi)的發(fā)育及區(qū)域表達(dá)，提示其參與神經(jīng)上皮干細(xì)胞分化及神經(jīng)發(fā)生。因此，有專(zhuān)家提議將LEDGF作為視網(wǎng)膜疾病的治療性蛋白和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子轉(zhuǎn)染的候選分子?；贚EDGFp75具有一定的眼部保護(hù)作用的研究前提、聯(lián)系LEDGFp52可能比LEDGp75生物

4、學(xué)作用更強(qiáng)的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、結(jié)合國(guó)際上對(duì)LEDGFp52這一轉(zhuǎn)錄活化子研究很少的事實(shí)和視神經(jīng)再生研究中積極尋找具有神經(jīng)保護(hù)和生長(zhǎng)促進(jìn)效能神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的要求，我們選擇LEDGFp52作為研究的目標(biāo)。那么，LEDGFp52作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的因子，它是否能對(duì)RGC起到神經(jīng)保護(hù)和生長(zhǎng)促進(jìn)作用呢?它對(duì)RGC神經(jīng)元生長(zhǎng)相關(guān)基因和蛋白又有什么影響呢?這有待于我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究來(lái)明確。 [目的]：在原代大鼠RGCs培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進(jìn)行LEDGFp52基

5、因和蛋白兩個(gè)水平正負(fù)雙向調(diào)控實(shí)驗(yàn)，觀(guān)察它們對(duì)大鼠RGCs突起數(shù)目及軸突長(zhǎng)度、RGC神經(jīng)元特異性相關(guān)基因和蛋白的調(diào)控，全面了解LEDGFp52基因和蛋白對(duì)大鼠RGCs生長(zhǎng)的影響，為研發(fā)更有效的RGC生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)因子奠定基礎(chǔ)，為探索視神經(jīng)損傷修復(fù)的新途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 [方法]：NEUROBASALTMMedia無(wú)血清體系培養(yǎng)RGCs，采用RT-PCR和細(xì)胞免疫熒光化學(xué)檢測(cè)LEDGFp52基因和蛋白在RGCs表達(dá)；構(gòu)建rhLEDGFp

6、52基因原核表達(dá)載體、誘導(dǎo)表達(dá)及純化蛋白；細(xì)菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建LEDGFp52基因腺病毒載體、體外表達(dá)及制各病毒；構(gòu)建siRNA-LEDGFp52真核表達(dá)載體、鑒定該載體并檢測(cè)其對(duì)LEDGFp52蛋白的抑制率。 1、LEDGFp52基因和蛋白對(duì)大鼠RGCs的突起數(shù)目及軸突長(zhǎng)度調(diào)控作用的觀(guān)察：分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組在大鼠RGCs培養(yǎng)36h后分別將LEDGFp52(2×10-4g/L)和Ab-LEDGF(2.5x10-4g/L)

7、加入RGCs的無(wú)血清培養(yǎng)基中，在LipofectamineTM2000介導(dǎo)下將Ad-LEDGFp52(2.5x10-4g/L)(3×10-4pfu/L)和siRNA-LEDGFp52(6x10-4g/L)轉(zhuǎn)染進(jìn)RGC，分別在處理后12h、24h、36h、48h、72h和96h在相差顯微鏡下觀(guān)察。設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組(CNTF10-4g/L)和空白對(duì)照組(不加處理因素)，觀(guān)察時(shí)相點(diǎn)同上。對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組的每組觀(guān)察孔數(shù)為12孔，重復(fù)3次。檢測(cè)指標(biāo)：R

8、GCs軸突長(zhǎng)度和單個(gè)細(xì)胞的突起數(shù)目。分析軟件：IPP圖像分析系統(tǒng)。 2、LEDGFp52基因和蛋白對(duì)RGC神經(jīng)元生長(zhǎng)相關(guān)基因和蛋白調(diào)控效應(yīng)的研究：處理因素及分組同上。檢測(cè)指標(biāo)：主要采用RT-PCR和細(xì)胞免疫熒光化學(xué)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)一步研究LEDGFp52對(duì)RGC神經(jīng)元生長(zhǎng)相關(guān)的GAP-43、NF-L和MAP-2基因與蛋白的調(diào)控。分析軟件：QuantityOne程序半定量分析各個(gè)目的基因在mRNA水平的相對(duì)含量，以待測(cè)基因與相應(yīng)內(nèi)參照光

9、密度比值計(jì)算相對(duì)系數(shù)；LSM510-Meta-Expert程序半定量分析各個(gè)目的蛋白的平均熒光強(qiáng)度相對(duì)數(shù)值。 [結(jié)果]： l、無(wú)血清的NEUROBASALTMMedia培養(yǎng)基是一種較好的RGCs培養(yǎng)體系；LEDGFp52基因及其蛋白在RGCs均有表達(dá)。 2、利用基因重組技術(shù)將rhLEDGFp52基因構(gòu)建于原核表達(dá)載體pET30a(+)中，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定證實(shí)構(gòu)建完全正確，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)其在大腸桿菌BL21(DE

10、3)中獲得可溶性形式表達(dá)，rhLEDGFp52蛋白表達(dá)量占菌體蛋白總量的34.63％。WesternBlot結(jié)果顯示rhLEDGF2蛋白能夠特異性與LEDGF-ab結(jié)合。Ni-NTAHis.Bind.Resin方法進(jìn)行純化后的rhLEDGFp52，終濃度達(dá)520μg.mL-1，分析其純度達(dá)87.93％。 3、成功將LEDGFp52基因片段亞克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV上構(gòu)建腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV-

11、LEDGFp52，并將腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV-LEDGFp52與5型腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1共轉(zhuǎn)染BJ5183細(xì)菌，經(jīng)細(xì)菌內(nèi)同源重組產(chǎn)生攜帶LEDGFp52基因重組腺病毒載體pAd-LEDGFp52，將pAd-LEDGFp52經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)化293細(xì)胞包裝產(chǎn)生重組腺病毒Ad-LEDGFp52，滴度可達(dá)5×1012pfu.L-1。將Ad-LEDGFp52體外轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，在該細(xì)胞中有效表達(dá)目的基因LEDGFp52，

12、CPE法及Westemblot均證實(shí)了該目的基因表達(dá)。 4、成功構(gòu)建LEDGFp52基因RNA干擾(RNAi)的真核細(xì)胞表達(dá)載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞48小時(shí)，Westemblotting檢測(cè)到LEDGFp52蛋白表達(dá)的改變，QuantityOne程序半定量分析LEDGFp52蛋白明顯下調(diào)了70％。 5、LEDGFp52在基因水平和蛋白水平均可調(diào)控RGCs生長(zhǎng)，表現(xiàn)為正向調(diào)節(jié)RGCs軸突顯著增長(zhǎng)，負(fù)向調(diào)節(jié)RGCs軸突

13、顯著縮短，而且正向調(diào)控時(shí)有高峰效應(yīng)。 6、LEDGFp52是RGC樹(shù)突化因子，同時(shí)也是RGC軸突延伸因子。 7、LEDGFp52在基因和蛋白兩個(gè)水平對(duì)RGC神經(jīng)元生長(zhǎng)相關(guān)的基因/蛋白GAP-43、NF-L和MAP-2的表達(dá)均有顯著的調(diào)控作用，表現(xiàn)為正向調(diào)節(jié)RGCs神經(jīng)元生長(zhǎng)相關(guān)基因/蛋白表達(dá)升高，負(fù)向調(diào)節(jié)RGCs神經(jīng)元生長(zhǎng)相關(guān)基因/蛋白表達(dá)降低。 [結(jié)論]： 1.首次確立了LEDGFp52基因及其蛋白在R

14、GCs的表達(dá)。 2.利用基因重組技術(shù)成功獲得rhLEDGFp52蛋白，終濃度達(dá)520μg.mL-1，純度達(dá)87.93％；經(jīng)細(xì)菌內(nèi)同源重組成功制備LEDGFp52的重組腺病毒，滴度可達(dá)5x1012pfu.L-1，并能夠在真核細(xì)胞中獲得高效穩(wěn)定的表達(dá)；利用RNAi技術(shù)可成功構(gòu)建抑制LEDGFp52表達(dá)的小干擾RNA重組體，該重組體使LEDGFp52蛋白明顯下調(diào)70％。 3.LEDGFp52基因和蛋白能顯著調(diào)控大鼠RGCs單個(gè)