視網(wǎng)膜前體細胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞分化的實驗研究.pdf

1、第一部分視網(wǎng)膜前體細胞的培養(yǎng)和鑒定 目的：分離和培養(yǎng)不同時期的RPCs并鑒定。 方法：分離E14和E18SD大鼠的RPCs，用改進DMEM／F12無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)并在體外誘導(dǎo)分化，倒置相差顯微鏡每天觀察細胞的生長和分化情況，免疫細胞化學(xué)、掃描電鏡和透射電鏡對RPCs進行鑒定。 結(jié)果：RPCs在DMEM／F12無血清培養(yǎng)基中懸浮成球，貼壁后，細胞逐漸從細胞球向周圍遷移分化。掃描電鏡可見細胞球和分化細胞的形態(tài)，透

2、射電鏡可見細胞球內(nèi)存在RPCs樣細胞，貼壁后形成神經(jīng)元樣和神經(jīng)膠質(zhì)樣細胞。免疫細胞化學(xué)顯示懸浮培養(yǎng)的細胞球中大部分細胞表達神經(jīng)外胚層源性干細胞標志Nestin和細胞分裂增殖標志BrdU，貼壁后，RPCs能分化為多種視網(wǎng)膜細胞類型，包括Thyl．1陽性的RGCs。E14和E18RGCs％分別為16．91％±4．05％和4．65％±L88％，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(仁15．04，P

3、清培養(yǎng)基可成功培養(yǎng)RPCs，培養(yǎng)的RPCs具有無限增殖和多向分化潛能。早期RPCs向RGCs分化的百分比較高 第二部分眼內(nèi)微環(huán)境對視網(wǎng)膜前體細胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞分化的影響 目的：研究視神經(jīng)鉗夾傷模型對RPCs向RGCs分化的影響。 方法：成年雄性SD大鼠，隨機選取左右眼進入試驗，試驗組為視神經(jīng)鉗夾傷模型，對照組暴露視神經(jīng)，但不鉗夾。分離培養(yǎng)E14SD大鼠的RPCs，用BrdU標記后分別移植到試驗組和對照組的玻璃

4、體腔，于移植后1w，2w，4w取眼球，免疫細胞化學(xué)檢測移植細胞的遷移、整合和分化情況。 結(jié)果：對照組移植的RPCs主要位于宿主玻璃體腔，隨著時間的推移，未見明顯的遷移和分化。試驗組移植的RPCs逐漸向宿主視網(wǎng)膜各層遷移，其中位于內(nèi)層視網(wǎng)膜的細胞數(shù)量明顯多于外層視網(wǎng)膜，以GCL為最多，隨著時間的推移，外層視網(wǎng)膜的細胞數(shù)量逐漸增多，但仍明顯少于內(nèi)層視網(wǎng)膜。免疫細胞化學(xué)顯示試驗組位于宿主視網(wǎng)膜不同層的移植細胞表達不同的視網(wǎng)膜細胞特異性

5、標志，Thyl．1陽性的細胞主要位于GCL，其次是INL。 結(jié)論：視神經(jīng)鉗夾傷模型能誘導(dǎo)RPCs遷移到GCL并向RGCs分化。 第三部分Muller細胞對視網(wǎng)膜前體細胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞分化的作用 目的：研究Muller細胞和MCM在RPCs向RGCs分化中的作用。 方法：分離培養(yǎng)P7SD大鼠的Muller細胞，E14和E18SD大鼠的RPCs，分別將不同時期的RPCs單獨培養(yǎng)(MuUer(一)組)，與M

6、uller細胞共同培養(yǎng)(№1ler(+)組)，用MCM誘導(dǎo)分化(MCM組)。倒置相差顯微鏡每天觀察細胞的生長和分化情況，Thyl．1標記RGCs并計數(shù)。 結(jié)果：不同時期，不同培養(yǎng)條件下的RPCs都能分化為多種視網(wǎng)膜細胞類型，包括ThyL1陽性的RGCs，但RPCs向一RGCs分化的百分比不同。E14，Muller(一)組，Muller(+)組和MCM組RGCs％分別為16．91％+4．05％，47．25％+9．67％和42．36

7、％-t-10．52％，E18則分別為4．65％4-1．88％，9．90％±3．19％和8．69％--+3．01％。Muller(+)組、MCM組與Muller(一)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0．05)。E14，Muller(一)組和MCM組RPCs增生細胞％分別為32．13％-+6．11％和57．07％-+9．31％，E18則分別為3L51％-+6．32％和56

8、．18％-+8．79％，MCM組與Mu／ler(一)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(tE14m12．28，P＜O．001；tE18=12．49，P

9、培養(yǎng)E14SD大鼠的RPCs，試驗組和對照組分別用含有Notch-1反義寡核苷酸鏈和無關(guān)序列寡核苷酸鏈的分化培養(yǎng)液進行誘導(dǎo)分化，倒置相差顯微鏡每天觀察細胞的生長和分化情況，Thyl．1標記RGCs并進行計數(shù)。 結(jié)果：試驗組和對照組的RPCs都能分化為多種視網(wǎng)膜細胞類型，包括Thyl．1陽性的RGCs，但兩組RPCs向RGCs分化的百分比不同。試驗組和對照組RGCs％分別為16．57％±4．31％和31．19％+6．90％，兩組比

10、較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9．84，P＜0．001)。 結(jié)論：Notch-1對RGCs的分化具有負向調(diào)控作用，阻斷Notch-1能促進RPCs向RGCs分化。 第五部分Math5調(diào)控視網(wǎng)膜前體細胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞分化目的：研究Math5對RPCs向RGCs分化的調(diào)控作用。 方法：分離培養(yǎng)E14SD大鼠的RPCs，構(gòu)建Math5-EGFP質(zhì)粒，以EGFP質(zhì)粒作為對照，轉(zhuǎn)染RPCs，倒置相差顯微鏡每天觀察轉(zhuǎn)染后RP

11、Cs的生長和分化情況，重點觀察其向RGCs的分化，Thyl．1標記RGCs并進行計數(shù)，同時用熒光定量RT-PCR的方法檢測RPCs分化不同時間點Math5相關(guān)基因的表達情況。 結(jié)果：Math5-EGFP／EGFP質(zhì)粒能成功轉(zhuǎn)染RPCs，轉(zhuǎn)染效率為24．68％。轉(zhuǎn)染后的RPCs仍能分化為多種視網(wǎng)膜細胞類型，包括Thyl．1陽性的RGCs。A組(Math5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組)，B組(空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組)和C組(未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組)RGCs％分別為30．

12、85％±6．28％，15．84％~3．55％和16．22％±3．60％，A組與B組、C組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P