牛冠狀病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、牛冠狀病毒（Bovine Coronavirus，BCoV）屬于冠狀病毒科，冠狀病毒屬2a亞群，是引起新生犢牛腹瀉、成年牛冬痢和呼吸道感染的重要病原。流行病學(xué)調(diào)查表明，牛冠狀病毒在牛場(chǎng)中普遍存在，主要通過消化道和呼吸道傳播，感染的牛長期帶毒并在一定時(shí)期內(nèi)持續(xù)排毒，易造成牛群的大范圍感染。因此，對(duì)帶毒牛的及時(shí)檢出和牛場(chǎng)環(huán)境監(jiān)測(cè)就顯得尤為重要。目前國內(nèi)外尚無針對(duì)BCoV感染治療的特效藥物，奶業(yè)發(fā)達(dá)國家應(yīng)用滅活疫苗或減毒疫苗預(yù)防本病，而我國尚

2、無相關(guān)商品化疫苗。因此，亟需建立該病毒快速敏感的檢測(cè)方法，并對(duì)我國部分地區(qū)奶牛場(chǎng)的BCoV流行情況進(jìn)行調(diào)查，及早發(fā)現(xiàn)BCoV感染的牛，掌握流行病學(xué)數(shù)據(jù)，以便及時(shí)采取更有效的針對(duì)性措施進(jìn)行防控，以減少該病毒對(duì)養(yǎng)牛業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失。
　　本研究根據(jù)GenBank收錄的牛冠狀病毒N基因序列，設(shè)計(jì)合成了1對(duì)擴(kuò)增N基因部分片段的特異性引物，以BCoV病毒的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化回收后送華大基因測(cè)序，將測(cè)序正確后的N基

3、因片段連接到pEASY-T3載體上，經(jīng)酶切鑒定、測(cè)序驗(yàn)證獲得了重組質(zhì)粒pEASY-T3-N。以得到的重組質(zhì)粒pEASY-T3-N為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行一系列稀釋，選取6個(gè)梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程。然后運(yùn)用常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，對(duì)2013～2014年本實(shí)驗(yàn)室采集的5個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)的212份臨床樣本進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)。最后設(shè)計(jì)合成了1對(duì)用于擴(kuò)增N基因全長的特異性引物，將PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物送測(cè)

4、序鑒定，應(yīng)用DNAstar生物學(xué)軟件將測(cè)得的N基因全長序列與GenBank中的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析。
　　序列測(cè)定表明，我們克隆獲得的100bp大小的片段正確，并且成功獲得了重組質(zhì)粒pEASY-T3-N陽性標(biāo)準(zhǔn)品。在建立的牛冠狀病毒SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法中，一個(gè)反應(yīng)體系中模板最低檢測(cè)限為7.8 copies/μL，比普通RT-PCR更加靈敏；熔解曲線只出現(xiàn)特異性的單個(gè)峰，而沒有明顯的引物二聚體或者非特異性

5、擴(kuò)增的峰出現(xiàn)，證明該方法具有良好的特異性。同時(shí)與牛輪狀病毒（bovine rotavirus，BRV)、牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛腸道病毒（bovine enterovirus，BEV）、牛流行熱病毒（bovine ephemeral fever virus，BE

6、FV）和牛副流感病毒3型（bovine parainfluenzavirus type3，BPIV-3）均無交叉反應(yīng)；批內(nèi)、批間重復(fù)變異系數(shù)均低于1.5％。因此，該方法敏感性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，為牛冠狀病毒的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)保障。
　　通過對(duì)臨床樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：在107份鼻拭子樣本中，BCoV感染陽性率為5.61%，同時(shí)檢測(cè)到BCoV分別與BVDV、IBRV、BPIV3混合感染陽性率依次為4.60%、4