重組人巨細胞病毒嵌合肽的表達純化及活性研究.pdf

1、人巨細胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染在人群中非常普遍,主要是呈隱性或亞臨床感染,近年來發(fā)現(xiàn)該病毒不只在新生兒、免疫抑制及免疫缺陷患者中導致廣泛的臨床癥狀和死亡,而且可能與人類三大疾病--心血管疾病,惡性腫瘤及糖尿病有關(guān),因而建立HCMV的快速檢測方法具有重要意義。多種HCMV病毒蛋白可刺激機體產(chǎn)生相應的抗體,選用抗原性強、特異性好的蛋白抗原代替全病毒以檢測HCMV感染,是提高HCMV感染診斷的敏感性和

2、特異性的有效途徑。國外的研究證實,HCMV的gp52蛋白和pp150蛋白具有較強的抗原性,在HCMV感染者的血清中其相應的抗體檢出率較高,本實驗室已成功構(gòu)建串連有編碼gp52 C末端和編碼pp150 C末端兩個基因片段的pPIC9K-rHCMVp表達質(zhì)粒,并在畢赤酵母獲得成功表達。但該質(zhì)粒缺少純化標記,不利于分離純化,本研究將該質(zhì)粒中人巨細胞病毒嵌合肽(rHCMVp)基因片段導入帶純化標志his6的pPICZαA中,重新構(gòu)建、篩選了表達

3、人巨細胞病毒嵌合肽(rHCMVp)的基因工程酵母。根據(jù)其基因序列,設(shè)計引物從pPIC9K-rHCMVp上擴增得到目的基因片段,并導入畢赤酵母誘導型表達載體pPICZαA中。通過電擊將線性化的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115細胞中,篩選獲得表達量較高的重組菌株,研究了該菌株生長的培養(yǎng)條件,包括不同誘導時間、甲醇濃度、pH值對人巨細胞病毒嵌合肽表達的影響。2L發(fā)酵罐進行了高密度發(fā)酵,經(jīng)1%的甲醇、pH6.0的條件下誘導48h,最終菌體密度O

4、D600達到180,每升發(fā)酵液中含目的蛋白78.7mg,比搖瓶提高了4.8倍的產(chǎn)量。rHCMVp嵌合肽蛋白可通過高密度發(fā)酵大量獲得。通過金屬螯合親和層析分離純化發(fā)酵液上清,獲得較高純度的rHCMVp嵌合肽蛋白,進行了活性研究。實驗結(jié)果證實該蛋白能被抗全病毒血清檢測,且具有免疫原性；與市售進口的ELISA人巨細胞病毒檢測試劑盒相比,兩種方法的一致性較好,我們選擇的gp52和pp150兩個片段的嵌合肽蛋白作為包被抗原可用于HCMV感染的檢測